Galectin-3在哮喘小鼠气道炎症中的作用及低分子柑桔果胶的干预

黄　娟　罗运春★

Galectin-3在哮喘小鼠气道炎症中的作用及低分子柑桔果胶的干预

黄娟罗运春★

目的 探讨小鼠肺组织半乳糖凝集-3（Galectin-3）表达水平及其与支气管哮喘的关系，研究低分子柑桔果胶（LCP）对哮喘小鼠肺组织Galectin-3表达及TH1/TH2平衡的影响。方法 用卵清白蛋白建立哮喘模型。将BALB/c小鼠随机分为五组：正常对照组（A组）、哮喘组（B组）、低分子柑桔果胶预防组（C组）、低分子柑桔果胶治疗组（D组）和地塞米松治疗组（E组），每组10只。留取支气管肺泡灌洗液（BALF）进行细胞总数计数和分类计数；应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验方法检测BALF中ⅠL-4、ⅠFN-γ浓度，采用免疫组化和RT-PCR法分别检测Galectin-3蛋白和Galectin-3 mRNA的表达。结果 哮喘组肺组织中 Galectin-3蛋白和Galectin-3 mRNA表达的强度均高于对照组，LCP预防组和治疗组均显著低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。Galectin-3及其mRNA表达与BLAF中的ⅠL-4浓度成显著正相关（r=0.791、0.761，P＜0.01），而与BLAF中的ⅠFN-γ浓度成显著负相关（r=-0.668、0.634，P＜0.01）。结论 哮喘小鼠肺组织Galectin-3高度表达，参与气道炎症的发生，LCP干预后下调Galectin-3表达，纠正Th1/Th2失衡。

哮喘 半乳糖凝集素-3 ⅠL-4 ⅠFN-γ 低分子柑桔果胶

半乳糖凝集素（Galectin）是一类能选择性识别糖结构并与之非共价结合的蛋白质，广泛分布于细胞表面、胞质、胞核及细胞外基质中。研究显示，半乳糖凝集素3（Galectin-3）可能与支气管哮喘的发病机制密切［1～3］。改良柑橘果胶（MCP）又称低分子柑桔果胶（LCP），其主要成分是半乳糖，能竞争抑制体内的Galectin-3配体，有效封闭和阻断Galectin-3的功能表达。作者通过建立哮喘小鼠模型，采用免疫组化和RT-PCR技术，检测Galectin-3在气道和肺组织中的表达，同时采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）对外周血中白细胞介素4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）的含量进行测定，观察LCP对Galectin-3蛋白、mRNA及TH1/TH2平衡的影响，为哮喘发病机制及防治开辟新的思路。

1　材料与方法

1.1小鼠哮喘模型的建立 SPF级BALB/c雄性小鼠50只（由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供），21～35d，体重14～18g，随机分为正常对照组（A组）、哮喘组（B组）、LCP预防组［LCP粉2400mg/（kg.d）］（C组）、LCP治疗组［LCP粉2400mg/（kg·d）］（D组）和地塞米松治疗组（0.5mg/kg）（E组）。每组10只。采用V级OVA制备模型，哮喘模型的制作参照文献［4］的方法略作改进。分致敏、激发两个阶段，LCP预防组分别于第1天开始每天AM 8：30按2400mg/kg灌胃LCP；第8天和第21天腹腔注射0.1ml含1%OVA的Al（OH）3凝胶致敏，各一次，共2次，第32天开始使用空气压缩雾化器向置于密闭有机玻璃容器内的小鼠喷雾1%OVA，每天吸入30min，连续定时激发1周。LCP治疗组于激发前每天AM 8：30按2400mg/kg灌胃LCP。地塞米松治疗组于每次激发前1h按0.5mg/ kg腹腔注射地塞米松液0.1ml。对照组以生理盐水代替OVA致敏和激发。

1.2 实验方法 各组末次激发24h内处死，眼球动脉取血，收集血清，每只小鼠左肺迅速留取肺组织，部分透明，石蜡包埋连续切片，用以光电镜标本制作和免疫组化，右肺进行支气管肺泡灌洗并留取支气管肺泡灌洗液（BALF）经2000rpm/min离心15min，取上清液-80℃ Eppendorf管保存用以检测IFN-γ和IL-4浓度。支气管肺泡灌洗小鼠收取BALF，细胞分类计数使用瑞士染色。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定BALF中IFN-γ、IL-4浓度，测定方法按试剂说明书进行操作。

1.3RT-PCR法测肺组织Galectin-3 mRNA的表达 引物设计和合成：检索GenBank数据库中mouse Galectin-3、GAPDH的mRNA序列，由上海基康生物工程有限公司设计并合成引物，Galectin-3：F 5，CCCGCATGCTGATCACAA 3，R 5 GGAGGTTCTTCATCCGATGGT 3；GAPDH F 5 CAAGTTCAACGGCACAGTCAA 3；R 5 TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC 3.

1.4统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。数据以（±s）表示。组间均数比较采用单因素方差分析（one way-ANOVA），两两比较方差齐者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett'T3检验，两变量的相关采用Pearson相关分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HE染色观察 哮喘组小鼠肺组织切片HE染色可见肺内支气管黏膜下、肺内支气管及血管周围较多炎性细胞浸润，以EOS、Lym、Neu为主，黏膜下水肿，黏液腺增生，黏膜皱折增多，气道上皮多处断裂和上皮细胞脱落，肺间质和支气管腔内可见炎性细胞渗出和分泌物，支气管壁略显增厚和基底膜轻度增厚且不规则，细支气管平滑肌轻度肥大。LCP预防组、治疗组及地塞米松治疗组小鼠肺组织炎性细胞浸润等病理改变较哮喘组减轻。

2.2PAS染色观察 正常对照组小鼠肺组织切片PAS染色未见黏液分泌；哮喘组PAS染色可见气道上皮杯状细胞增生肥大，大量黏液形成，并可见气管腔内黏液栓；LCP预防组、治疗组及地塞米松治疗组肺组织PAS染色与哮喘组比较，杯状细胞增生不明显，黏液分泌明显减少。

2.3电镜观察 正常对照组小鼠显示正常肺泡Ⅱ型上皮细胞（可见板层小体）支气管纤毛上皮细胞纤毛排列齐整，肺泡隔结构正常，表面微绒毛丰富；未见淋巴细胞及嗜酸性粒细胞附壁及浸润；肺细小动脉内膜、中膜、外膜清晰，内皮细胞扁平，平滑肌细胞之间有散在的胶原纤维，哮喘组小鼠电镜观察显示肺间质有EOS浸润，肺泡Ⅱ型上皮细胞水肿，核轻度固缩，胞浆部分内质网扩张，表面微绒毛部分脱落，线粒体轻度肿胀。支气管纤毛上皮细胞纤毛排列稀疏，有断裂、融合现象；肺泡腔及血管壁有多个巨噬细胞浸润。

2.4各组小鼠BALF中细胞计数与分类计数的比较 见表1。

表1　各组小鼠BALF中细胞总数和分类计数（±s）

表1　各组小鼠BALF中细胞总数和分类计数（±s）

注：与A组比较*P＜0.01；与B组比较△P＜0.05，△△P＜0.01

组别鼠数细胞总数（×107/L）细胞分类计数（%）LymNEUMфEOS A组1022.40±1.06.35±0.955.13±0.4898.75±.6.230.61±.0.03 B组10100.28±2.24*11.61±0.35*11.87±0.48*66.90±9.75*11.33±.0.72* C组858.40±4.43*△△9.80±1.14*8.91±1.26*△70.54±10.81*6.31±.0.32*△D组991.43.± 5.48*15.36±3.01*10.15±.1.01* 67.78±8.54*8.85±.1.39*△E组1037.73±2.67*△△8.87±0.68*△△8.81±0.97*△80.42±2.38*△2.51±.0.32*△△

2.5各组BALF中IFN-γ、IL-4浓度的变化 见表2。

表2　各组小鼠BALF中IFN-γ、IL-4浓度的变化［pg/ml，（±s）］

表2　各组小鼠BALF中IFN-γ、IL-4浓度的变化［pg/ml，（±s）］

注：与A组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较△P＜0.05

组别鼠数（只）IFN-γIL-4 A组818.85±7.3237.14±3.70 B组86.20±4.38**148.87±30.90** C组89.42±4.69**75.54±10.03**△D组87.24±3.21**98.40±28.80* E组88.65±3.39**72.42±7.96**△F值6.8634.60

2.6肺组织中Galectin-3蛋白和Galectin-3 mRNA的变化 见表3。

表3　各组小鼠肺组织Galectin-3蛋白表达情况（±s）

表3　各组小鼠肺组织Galectin-3蛋白表达情况（±s）

注：与A组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较△P＜0.05，△△P＜0.01

组别鼠数（只）Galectin-3蛋白Galectin-3 mRNA A组100.18±0.030.20±0.07 B组100.32±0.01**0.39±0.01** C组80.25±0.01**△△0.34±0.01*△△D组90.29±0.01**△0.34±0.03*△E组100.22±0.02**△△0.29±0.01△△F值80.9138.82

RT-PCR显示肺组织Glectin-3 mRNA表达：B组高于A组（P＜0.01），C、D、E组均低于B组（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01）。相关分析显示，肺组织中Galectin-3、Glectin-3 mRNA含量与BALF中IL-4浓度分别成正相关［（r=0.791，P＜0.01），（r=0.761，P＜0.01）］；而Glectin-3 mRNA含量与BALF中IFN-γ浓度成负相关［（r=-0.668，P＜0.01，（r=-0.634，P＜0.01）］。

3　讨论

支气管哮喘是全球范围内威胁公众健康的最常见慢性呼吸道疾病，发病机制还未完全明确。近年来Galectin在哮喘中的作用逐渐引起重视，已成为探讨哮喘发病机制及治疗的新方向。

Galectin属于可溶性免疫调节蛋白，能通过调节信号通路在胞内发挥作用，或作为生物活性调节介质在胞外发挥作用，在炎性反应、细胞凋亡、细胞粘附和肿瘤转移等多种生理和病理过程中发挥重要作用［5］Galeetin-3是这个家族最具特征的成员，由一个长的N末端结构域（调节区）和C末端的单一糖识别域（CRD结构域），其羧基端是糖识别域组成。它是一种多效蛋白，主要表达于上皮细胞、树突状细胞及各种炎症细胞中［6］。Cecilia等［7］报道支气管哮喘患者Galectin-3主要高表达在气道上皮细胞，腺上皮，内皮细胞，成纤维细胞和平滑肌细胞。其通过与其糖结合物配体等结合，使得其N末端调节区形成寡聚化参与调节细胞粘附，细胞增殖、单核巨噬细胞趋化、内皮细胞和血管生成及信号传导等。其它机制包括通过结合这些细胞表面的肽聚糖激活多种类型炎症细胞释放炎症介质。外源性的Galectin-3与T细胞表面的糖蛋白结合，可直接介导T细胞的死亡［1］。Zuberi等［8］研究发现Galectin-3基因敲除（Lgals3-/-）急性哮喘小鼠模型，显示出明显降低的气道炎症和气道高反应性，嗜酸性粒细胞浸润和杯状细胞生成亦明显减少。Xiao等［2］进一步研究发现Galectin-3基因敲除的慢性哮喘小鼠模型显示出气道重塑明显受抑制，主要表现在嗜酸性粒细胞聚集减少，IL-5 和 IL-13表达下调，嗜酸细胞活化趋化因子（eotaxin）、转化生长因子（TGF-b1）及血管生成介质明显减少。作者通过BALF中细胞总数和分类计数发现由OVA激发的支气管哮喘小鼠模型嗜酸性粒细胞计数明显增高，免疫组化和RT-PCR观察哮喘小鼠肺组织Galectin-3的表达明显增高，主要表达于气道上皮细胞及散在的炎性细胞，与文献报道一致。Galectin-3表达与BALF细胞总数、嗜酸粒细胞百分比、IL-4浓度的浓度呈正相关变化。说明哮喘气道上皮细胞和肺组织Galectin-3的过度表达很可能是导致哮喘气道炎性细胞募集和炎性介质分泌增多的主要原因。从而证实Galectin-3参与哮喘发病机制。因此，探讨如何通过药物抑制肺组织Galectin-3的高表达对调控哮喘气道炎症的发生、发展有重要价值。

柑桔果胶（CP）是从柑橘类植物细胞壁中提取的一种支链天然多糖，其主要成分是半乳糖，LCP则是CP经过特定Ph值和温度处理后，分支结构减少，更富含半乳糖和糖链结构的产物［3］。CP和LCP自身对细胞Galectin-3的表达和分泌无影响。LCP作为Galectin-3的高亲和力配体与Galectin-3的CRD作用，竞争抑制体内的Galectin-3配体［9］。此外由于其分子量小，无抗原性，无毒性，水溶性好，容易被胃肠道吸收而进入血液系统发挥作用，对机体的特异性和非特异性免疫产生影响 。PlattD 等［9］通过体外细胞凝集试验和细胞粘附试验证实，LCP可通过封闭细胞表面的galectin-3而抑制细胞间的相互识别和粘附功能。目前国内外已用于肿瘤领域的临床治疗。而在糖尿病、高血脂、铅中毒等方面的防治也正成为研究的热点。是否LCP能用于哮喘的防治，目前国内外尚无报道。

本资料首次发现LCP预防组、治疗组肺组织支气管及血管周围炎症细胞浸润明显减少，BALF液涂片EOS%较正常组明显下降，BALF液中IL-4浓度降低；免疫组化和RT-PCR显示LCP预防组的气道、肺组织Galectin-3及mRNA表达较哮喘组明显下降，表明低分子柑橘果胶减轻哮喘小鼠肺部炎症反应，一定程度上增强Th1免疫反应或抑制亢进的Th2免疫反应，从而改善哮喘发病机制中Th1/Th2的失衡。其发生机制可能与上述的竞争抑制体内的Galectin-3配体和自身的免疫调节有关。本实验还发现地塞米松治疗组显著降低的Galectin-3表达，与文献报道一致［10］，但激素长期治疗哮喘的副作用不容忽视。LCP联合激素治疗是否有协同作用，是否能降低激素的用量是未来研究的方向。LCP无毒性，来源于水果，资源丰富，价格低廉，且不会与药物发生化学反应，其开发应用价值和潜力巨大，望能为哮喘的预防治疗开辟新的途径。

1 Stillman B N， Hsu D K， Pang M， et al . Galectin-3 and Galectin-1 bind distinct cell surface glycoprotein receptors to induce T cell death. J Immunol， 2006，176 （2） ：778～789.

2 Xiao Na Ge， Nooshin S. Bahaie， Bit Na Kang et al. Allergen-Induced Airway Remodeling Is Impaired in Galectin-3 Deficient Mice J Immunol.2010，185：1205～1214.

3 Nangia-Makker P，Hogan V， Honjo Y，et al. Inhibition of human cancer cell growth and metastasis in nude mice by oral intake of modified citrus pectin . J Natl Cancer Inst，2002，94：1854～1862.

4 李昌崇，张维溪，陈小芳，等.巨噬细胞炎性蛋白1及其mRNA在哮喘小鼠气道炎症中的作用.中华儿科杂志，2004，42（2）：90～93.

5 Rabinovich GA， Toscano MA. Turning 'sweet' on immunity： galectinglycan interactions in immune tolerance and inflammation. Nat Rev Immunol， 2009， 9（5）： 338～352.

6 Yang R Y，Rabinovich G A，Liu F T. Galectins： structure，function and therapeutic potential .Expert Rev Mol Med，2008，10：el7.

7 Cecilia C， Johan M， Kristian N. et al. Glycoproteomic identification of galectin-3 and -8 ligands in bronchoalveolar lavage of mild asthmatics and healthy subjects. Biochimica et Biophysica Acta 1820 （2012）1429～1436.

8 Zuberi RI， Hsu DK， Kalayci O， et al. Critical role for galectin-3 in airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma. Am J Pathol， 2004， 165（1）：2045～2053.

9 Platt D， Raz A . Modulation of the lung colonization of B16-F1 melanomacells by citrus pectin J Natl Cance rInst，1992， 84 （ 6 ） ： 438～ 442 .

10 Dabelic S， FlogeI M， Dumic J.Hydrocortisone and dexamethasone affect the galectin-3 expression Period biol，2005，107：175～181.

Objective To evaluate the expression of galectin-3 in mice lung tissue，and to explore the role of galectin-3 in the bronchus of a mouse model of asthma. To access the effect of Low-Molecular-Weight Citrus Pectin（ LCP） on the expression of Galectin-3，Galectin-3mRNA and the level of Th1/Th2 balance. Methods Fifty male BALB/c mice were randomly divided into fi ve groups ： the control group，asthma group，LCP prevented group and LCP treated group and dexamethasone treated group.Ⅰn the experiment，the mouse model of asthma was established by the ovalbumin（ OVA） challenge Methods. Counts of total cell numbers and differentiated cell numbers in bronchoalveolar lavage .The protein expression of Galectin-3 was detected by Ⅰmmuno-histochemistry（ⅠHC）； the mRNA expression of Galectin-3 was detected by transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）. Results Ⅰmmunohistochemical staining and transcriptase polymerase chain reaction showed that the protein content of Galectin-3 and Galectin-3mRNA expression in the lung tissue of asthma group were significantaly higher than that of the control group，while those of LCP prevented group and LCP treated group were signifi cantly lowed than asthma group .（P＜0.05 or P＜0.01）. The Galectin-3 and the Galectin-3mRNA expression had positive correlation with the concentration of ⅠL-4 in BALF.（r=0.791、0.761，P＜0.01） while had negative correlation with the ⅠFN-γin BALF.（r=-0.668、0.634，P＜0.01） Conclusion Galectin-3mRNA and Galectin-3 were strongly expressed in airway and lung of sensitized mouse. LCP can downregulate expression of Galectin-3mRNA，reduce airway infl ammation and modulate Th1/Th2 balance.

Asthma Galectin-3 ⅠL-4 ⅠFN-γ LCP

437000 湖北省咸宁市中心医院儿内科（黄娟）

325000 温州医学院附属育婴儿童医院儿童呼吸科（罗运春）