大环抗生素手性固定相拆分克伦普罗对映体及分离机制研究

张丹丹， 张晓琳

(青岛科技大学化工学院，山东青岛 266042)

图1 克伦普罗的结构式

盐酸克伦普罗它是一种β2肾上腺受体激动剂，主要用于防治人、畜支气管哮喘和痉挛[1]，结构式见图1，其分子中含有一个手性中心，具有一对呈镜像对映关系的异构体，但目前应用的盐酸克伦普罗均为外消旋体。而手性化合物的对映体常具有不同的药理、毒理作用及药物动力学特征[2 - 5]。因此，对盐酸克伦普罗对映体进行拆分研究，建立简单、快速、分离性能好、灵敏的测定方法是一个具有理论及实际意义的课题。目前，对盐酸克伦特罗对映体拆分的报道较多[6 - 8]，但是对盐酸克伦普罗对映体的分离罕见报道，仅见杨晶等[9]采用柱前衍生化反相高效液相色谱法对其进行了分离，但需要进行衍生化反应，方法繁琐耗时，不好控制。

本研究采用三种大环抗生素类手性固定相Chirobiotic V、Chirobiotic T 和Chirobiotic R(结构式见图2)对盐酸克伦普罗对映体直接进行分离，考察分离模式、流动相组成及柱温的影响，研究对映体的热力学行为，探讨手性分离的机制。

图2 三种大环抗生素类手性固定相的结构式

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Jasco色谱仪(日本,分光公司),附Jasco UV-980高压输液泵，Jasco UV-975检测器，IC 2001 plus 型柱温箱，Anastar 色谱工作站;DT-100A型分析天平;pHS-25型pH计;DL-180型超声波清洗机。

盐酸克伦普罗标准品由青岛双鲸药业提供，用甲醇溶解，配制成浓度为1.0 mg/mL的贮备液，使用时稀释至所需浓度。甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃为色谱纯(天津市康科德科技有限公司)；冰乙酸、三乙胺、硝酸铵为优级纯(天津市博迪化工有限公司)。

1.2 色谱条件

色谱柱:Chirobiotic V柱(250×4.6 mm i.d.,5 μm),Chirobiotic T柱(150×4.6 mm i.d.,5 μm) 和 Chirobiotic R柱(250×4.6 mm i.d.,5 μm)(Advanced Separation Technologies Inc.，美国)。流动相：甲醇-乙酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,V/V/V)。流速:1.0 mL/min；紫外检测波长:254 nm；进样量:20 μL。

2 结果与讨论

2.1 新极性有机相模式下盐酸克伦普罗对映体的分离

新极性有机相模式是指流动相只使用极性有机溶剂，添加适量的有机酸和碱来改善其对映体选择性。这个模式结合了反相液相色谱的优点，如增加了样品的溶解性，溶剂更容易蒸发等，但是流动相中不含水相。当被分析物的分子结构中含有一个以上可以与手性固定相的手性位点发生相互作用的官能团时，新极性有机相模式就可以被使用。盐酸克伦普罗的结构中含有多个可以与手性位点发生相互作用的官能团，如羟基，氨基和苯基等，因此，新极性有机相模式被确定为首选的分离模式。

2.1.1缓冲溶液类型对分离的影响本文考察了0.1%乙酸铵、0.1%硝酸铵和0.1%乙酸三乙胺三种缓冲体系对分离的影响。结果发现，盐酸克伦普罗在0.1%乙酸铵和硝酸铵缓冲体系中不能实现分离，且色谱峰拖尾，对称性较差。而在0.1%乙酸-三乙胺缓冲体系中可以得到一定的手性分离，因此在后续实验中，选用0.1%乙酸-三乙胺做为流动相的缓冲系统。

2.1.2缓冲溶液浓度对分离的影响以甲醇-乙酸-三乙胺体系作为流动相，考察了乙酸和三乙胺的浓度和比例对分离的影响。在Chirobiotic R手性固定相上，无论如何优化条件，盐酸克伦普罗对映体均不能实现分离。在Chirobiotic V和Chirobiotic T手性固定相上，当流动相中只含有乙酸而不含有三乙胺时，不能实现手性分离；在含有三乙胺的流动相中，盐酸克伦普罗可实现一定的分离，乙酸的加入对化合物的手性识别不起主要作用，但可以改善色谱峰的峰形和对称性。本文采用甲醇-乙酸-三乙胺(100∶0.1∶0.1,V/V/V)为起始流动相，考察了缓冲液成分(乙酸-三乙胺)的浓度对盐酸克伦普罗保留行为和对映体选择性的影响。随着乙酸-三乙胺的浓度从0.1%降低至0.02%或0.01%，盐酸克伦普罗保留时间明显延长，分离效果显著提高；但当乙酸-三乙胺的浓度继续降低至0.005%时，保留时间过长，色谱峰展宽，分离效果下降。具体数据见表1。实验确定甲醇-乙酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,V/V/V)为最佳流动相，在此条件下，盐酸克伦普罗在Chirobiotic V和Chirobiotic T手性固定相上，均可实现基线分离，分离色谱图见图3，其对映体洗脱顺序由Jasco OR-990手性检测器测得，均为(-)-对映体先被洗脱。

2.1.3柱温对分离的影响及热力学性质研究本文以甲醇-乙酸-三乙胺(100∶0.01∶0.01,V/V/V)为流动相，考察了盐酸克伦普罗在10、20、30和40 ℃下的分离情况。随着温度的降低，盐酸克伦普罗的保留时间延长，对映体选择性有所提高。具体数据见表2。权衡分离度，保留时间及实际操作性，选取最佳分离温度为20 ℃。根据Van’t Hoff 等式，色谱参数、柱温和热力学参数的关系为：lnα=-△H/RT+△S/R，式中R为气体常数，T为绝对温度，△H和△S分别代表对映体与手性固定相相互作用的焓变差和熵变。在表2考察的温度范围内，得到盐酸克伦普罗在Chirobiotic V手性固定相上的△H和△S分别为-114.23 kJ/mol和-0.22 J/(mol·K)，在Chirobiotic T手性固定相上的△H和△S分别为-167.97 kJ/mol和-0.29 J/(mol·K)，数值均为负值，表明其手性识别过程均为焓控过程。

表1 流动相组成对盐酸克伦普罗对映体保留行为和分离的影响

图3 盐酸克伦普罗对映体在Chirobiotic V(a)和Chirobiotic T(b)手性固定相上分离的色谱图

表2 温度对克伦普罗在替考拉宁手性固定相上分离效果的影响

2.2 反相模式下盐酸克伦普罗对映体的分离

本文采用20%甲醇0.1%TEA为起始流动相，考察了硝酸铵和乙酸三乙胺两种缓冲盐系统，并在该固定相所适应的pH值范围内(4.0～7.0)考察了缓冲盐pH值变化及有机改性剂种类(甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃等)对盐酸克伦普罗对映体保留行为和分离影响，该模式下盐酸克伦普罗对映体在三种大环抗生素手性固定相上均不能实现分离。

2.3 正相模式下克伦普罗对映体的手性分离

本文考察了两种流动相系统:正己烷-乙醇和正己烷-异丙醇，并通过改变流动相组成以求实现手性分离，但结果表明，盐酸克伦普罗对映体在三种大环抗生素手性固定相上均不能实现分离。

2.4 分离机制的探讨

Chirobiotic V、Chirobiotic T和Chirobiotic R手性固定相，可与对映体发生π-π相互作用，氢键作用，包合作用，偶极作用，立体化学作用和离子相互作用。本研究中，在Chirobiotic V和T手性固定相上，只有在新极性有机相模式下，流动相中同时含有三乙胺和乙酸时，盐酸克伦普罗对映体才能实现较好的分离，这说明离子作用是对映体分离的最主要作用机制，而其手性分离是上述提到的各种相互作用的共同结果。在正相模式下，盐酸克伦普罗对映体不能得到分离，这进一步证明了离子相互作用在盐酸克伦普罗对映体分离时的必要性，因为离子相互作用在正相模式下是很难，甚至不可能发生的。盐酸克伦普罗对映体在Chirobiotic R固定相上没能实现手性分离，这主要是由于Chirobiotic R的结构中缺少羧基，而羧基是与克伦普罗发生离子相互作用的重要手性位点之一，进一步证明了离子相互作用是实现对映体分离的最必要作用。

3 结论

本文采用三种大环抗生素类手性固定相Chirobiotic V、Chirobiotic T和Chirobiotic R对盐酸克伦普罗进行了拆分研究，在Chirobiotic V、Chirobiotic T手性固定相上成功实现了其对映体的基线分离，分离度RS可分别达2.00和2.13。本文建立的盐酸克伦普罗拆分方法简单,操作方便,可以用于其对映体的质量控制及立体选择性药代动力学的研究。