超高效液相色谱-荧光检测法测定人体尿液中酪氨酸、对羟苯基乳酸和对羟苯基乙酸

冯 蕾， 马雅倩， 谭 婷,， 鄢爱平， 郭 岚， 万益群*,

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330047；2.南昌大学分析测试中心，江西南昌 330047)

酪氨酸(Tyr)是人体重要的半必需氨基酸，对羟苯基乳酸(PHPLA)和对羟苯基乙酸(PHPAA)是Tyr的酚酸类代谢产物。研究表明，Tyr的代谢紊乱不仅与氨基酸代谢疾病有关[1 - 3]，而且与恶性肿瘤有一定的相关性[4 - 7]。在Tyr及其代谢产物的研究中，以血清中Tyr及其代谢产物的研究报道较多[8 - 10]，而对人体尿液中Tyr及其代谢产物的研究相对较少。因此，探索Tyr及其代谢产物含量的分析新技术并应用于尿液样品测定，对癌症的辅助诊断、治疗和监测具有十分重要的临床意义。

目前，Tyr、PHPLA和PHPAA的分离测定主要采用高效液相色谱法[10 - 17]。其中，紫外分析法[11，12]的灵敏度较低，不适用于体液中Tyr代谢产物的分析测定；质谱分析法[13，14]设备昂贵难于普及，从而限制了其在Tyr及其代谢产物研究中的应用。由于Tyr及其代谢产物具有自体荧光，应用高效液相色谱-荧光检测法分析测定Tyr及其代谢产物的研究已见报道[15 - 17]，而将其应用于人体尿液中Tyr、PHPLA和对PHPAA的同时测定尚未见报道。基于此，本文采用固相萃取技术，结合超高效液相色谱-荧光检测法(UPLC-FLD)，建立了健康人和胃癌患者尿液中Tyr、PHPUA和PHPAA的同时分析新方法，并取得了较为满意的结果。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1290超高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)，配有G4220A二元泵、G4226A自动进样器、G1316C柱温箱、G1321B荧光检测器(FLD)和ChemStation B.04.02色谱工作站；pHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂)；Milli-QS超纯水装置(美国，Millipore公司)；MS2迷你振荡器(广州仪科实验室技术有限公司)；TEL-40B低速台式大容量离心机(上海安亭仪器厂)。Supelco ENVI-18固相萃取小柱(500 mg/3mL)，Clean-Up BCX固相萃取小柱(CUBCX153,500 mg/3mL)，Clean-Screen DAU固相萃取小柱(CSDAU506,500 mg/6mL)，国产717型阴离子交换树脂(上海争光树脂厂)。

Tyr标准品(纯度>99%，美国Acros Organics 公司)；PHPAA标准品(98%，日本东京化成工业株式会社)；PHPLA标准品(纯度>98%，美国Sigma公司)。甲醇、乙腈和异丙醇(色谱纯，美国Tedia公司)；其他试剂均为分析纯。分别准确称取Tyr、PHPLA、PHPAA标准品0.01250 g于25 mL容量瓶，用1%的甲酸溶解并定容，摇匀，配制成500 mg/L的标准储备液，置于冰箱内4 ℃保存。使用时用缓冲溶液(50 mmol/L甲酸铵,甲酸调pH=5.8)稀释至所需浓度。实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 尿样的采集与处理

取健康人(n=8,南昌大学志愿者)和胃癌患者(n=10,南昌大学第一附属医院)空腹(早晨7～8时)尿液50 mL，采集后的尿样于常温下以4 000 r/min离心10 min后分离得上层清液，若不能及时检测，可置于-20 ℃冰箱保存。

Clean-Screen DAU固相萃取小柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。准确吸取1.0 mL尿液(甲酸调pH=3.0)通过已活化的Clean-Screen DAU固相萃取小柱，待尿液基本流出后，静置10 min，用3 mL超纯水淋洗，调节流速为每分钟20滴，淋洗液弃去。用10 mL pH=5.8的甲酸铵-甲酸缓冲液∶甲醇=95∶5(V/V)洗脱，调节流速为每分钟20滴，收集洗脱液于10 mL棕色容量瓶中，过0.22 μm水系滤膜，待测。

1.3 色谱分析条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18快速分离柱(100×2.1 mm,1.8 μm;美国Agilent公司)；柱温：25 ℃；流动相：pH=5.8的甲酸铵-甲酸缓冲溶液∶乙腈=95∶5(V/V)；流速：0.20 mL/min；荧光检测波长：λex=277 nm，λem=316 nm；进样量：5 μL；采样时间：15 min。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择与优化

图1 酪氨酸及其代谢产物标准色谱图

探讨流动相中缓冲溶液pH(甲酸铵-甲酸,50 mmol/L)、有机相比例以及流速对Tyr、PHPLA和PHPAA色谱分离行为的影响。结果发现，当pH<5.5时，Tyr出峰时间提前，实际样品测定时存在干扰；当pH>6.0时，PHPLA和PHPAA无法完全分离。因此，本实验选择pH=5.8的甲酸铵-甲酸(50 mmol/L)缓冲体系。由于人体尿液成分复杂，Tyr出峰时间太早，易存在干扰，通过实验探索，选择有机相为5%乙腈，流速为0.20 mL/min。由图1可知，在优化的色谱条件下，Tyr及其代谢产物的分析时间短，分离效果好。

2.2 标准曲线与检测限

取适量的标准储备液(500 mg/L)，配制成一系列不同浓度的混合标准工作溶液，在优化的色谱条件下测定，以色谱峰面积(A)对浓度(c)进行线性拟合。结果表明，Tyr、PHPLA和PHPAA的线性范围分别为0.120～12.00 mg/L、0.060～3.00 mg/L和0.048～4.80 mg/L，线性相关系数在0.9996～0.9998之间，线性关系较好。三种物质的检出限(S/N=3)均为0.016 mg/L，定量限(S/N=10)均为0.040 mg/L；回归方程参数见表1。与已报道的方法[12,15,17 - 19]相比，本方法具有较高的灵敏度(表2)。

2.3 样品前处理方法选择

人体尿液基体复杂，为保证分析结果的准确性，实验探讨了以下前处理方法：(1)取晨尿4 mL，以10 000 r/min离心10 min，取上清液1.0 mL至10 mL棕色容量瓶，缓冲溶液(甲酸铵-甲酸,50 mmol/L,pH=5.8)定容，过0.22 μm水系滤膜，进样。(2) ENVI-18固相萃取小柱萃取。ENVI-18依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，尿液(1.0 mL)通过已活化的ENVI-18固相萃取小柱，待基本流出后，静置10 min，超纯水淋洗，pH=5.8的甲酸铵-甲酸缓冲液∶甲醇=95∶5(V/V)洗脱，收集洗脱液(10 mL)，过0.22 μm水系滤膜，进样。(3) 717型阴离子交换柱分离。尿液(1.0 mL)通过已活化的717型阴离子交换柱，超纯水淋洗，缓冲溶液(甲酸铵-甲酸,50 mmol/L,pH=5.8)、甲酸(1%,5%,10%,15%,20%)、碳酸铵(1 g/L,5 g/L)洗脱，收集洗脱液(10 mL)，过0.22 μm水系滤膜，进样。(4) Clean-Up BCX固相萃取小柱萃取。Clean-Up BCX依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，尿液(1.0 mL,甲酸调节pH=3.0,5.0,6.0;氨水调节pH=8.0,9.0)通过已活化的Clean-Up BCX固相萃取小柱，待基本流出后，静置10 min，超纯水淋洗，缓冲溶液(甲酸铵-甲酸,50 mmol/L,pH=5.8)洗脱，收集洗脱液(10 mL)，过0.22 μm水系滤膜，进样。(5) Clean-Screen DAU固相萃取小柱萃取。Clean-Screen DAU依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，尿液(1.0 mL,甲酸调节pH=3.0,5.0,6.0)通过已活化的Clean-Screen DAU固相萃取小柱，待基本流出后，静置10 min，超纯水淋洗，pH=5.8的甲酸铵-甲酸缓冲液∶甲醇=95∶5(V/V)洗脱，收集洗脱液(10 mL)，过0.22 μm水系滤膜，进样。

表1 酪氨酸及其代谢产物的线性范围、线性方程、相关系数及检测限

表2 方法检测限的对比

图2 尿液经不同处理方法的色谱图

实验结果显示，采用离心、稀释、过膜方式处理的尿样，杂质较多，对色谱柱的损伤较大，且待测物(尤其是PHPAA)的保留时间发生偏移，影响待测物的分析测定(图2)。选用ENVI-18固相萃取小柱，虽然可以去除尿液中部分脂肪和蛋白质等有机物，但杂质扔较多，对Tyr及其代谢产物的分析测定仍有影响。经717型阴离子交换柱处理过的样品，干扰物质得到了很好的去除，但由于717阴离子交换柱对Tyr及其代谢产物的保留能力较强，实验使用了不同强度洗脱剂，待测物的回收率均低于20%。在Clean-Up BCX固相萃取小柱上，调节尿液pH(3.0～9.0)，Tyr及其代谢产物被Clean-Up BCX保留均较弱，干扰物去除效果不佳。Clean-Screen DAU固相萃取小柱基质表面键合了反相基团和苯磺酸离子交换基团，随着尿液pH的降低，Clean-Screen DAU对Tyr及其代谢产物的保留能力增强，当尿液pH=3.0时，经Clean-Screen DAU处理的尿样，有效去除了非极性有机物，同时也消除了无机物及离子型化合物对待测物分析测定的影响，且Tyr及其代谢产物易于洗脱，回收率在86.9%～107.9%之间，效果良好(图2)。因此，实验选用Clean-Screen DAU固相萃取小柱对尿液进行前处理。

2.4 方法回收率与精密度

取健康人和胃癌患者尿液，分别添加三个不同水平Tyr、PHPLA和PHPAA进行回收率和精密度实验，未加标尿液和加标尿液按照1.2节进行前处理后，按1.3节的色谱条件进行测定，每个水平平行实验6次，结果见表3、表4，色谱图如图3、图4所示。实验结果显示，健康人和胃癌患者尿液中三种待测物的回收率在95.2%～107.8%和86.9%～107.9%之间，相对标准偏差(RSD)分别在0.6%～2.8%和0.5%～2.5%之间。以上结果表明，该方法准确可靠，可用于实际样品的测定。

表3 健康人尿液加标回收结果(n=6)

表4 胃癌患者尿液加标回收结果(n=6)

图3 健康人尿液色谱图

图4 胃癌病人尿液色谱图

2.5 样品测定

应用所建立的分析方法，对8个健康人尿液(1～8号由南昌大学志愿者提供)和10个胃癌患者尿液(9～18号由南昌大学第一附属医院提供)进行分析，结果如表5所示。由表5可知，与健康人相比，胃癌患者尿液中PHPAA的含量有升高趋势。

表5 健康人和胃癌患者尿液中酪氨酸及其代谢产物分析结果(n=5)

*not detected.

3 结论

本文建立了固相萃取，结合超高效液相色谱-荧光检测法测定人体尿液中酪氨酸、对羟苯基乳酸和对羟苯基乙酸的分析方法，探讨了不同机理下，应用固相萃取技术处理尿液的效果，成功地除去了大量干扰物质，结果令人满意。三种物质线性关系良好(R2>0.9996)，检测限均为0.016 mg/L；在三个水平的加标回收实验中，回收率在86.9%～107.9%之间，相对标准偏差小于2.5%。该方法利用酪氨酸及其代谢产物的自体荧光特性，无需衍生即可测定，方法快速、灵敏度高、选择性好，可用于人体尿液中三组分的同时测定。检测结果表明，胃癌患者和健康人尿液中酪氨酸及其部分代谢产物的含量有一定差异，为进一步研究酪氨酸及其代谢产物与癌症的相关性提供了方法学参考。