复方真元颗粒的提取工艺研究

2015-10-18张晓杭李伟锋蒋建兰

中成药 2015年3期

关键词：星点甘草酸甘草

李妍，袁乐，张晓杭，曹颂，李伟锋，蒋建兰*

（1.天津大学化工学院制药工程系，天津　300072；2.天津安仁中医医院，天津　300193）

复方真元颗粒的提取工艺研究

李妍1，袁乐2，张晓杭1，曹颂1，李伟锋1，蒋建兰1*

（1.天津大学化工学院制药工程系，天津300072；2.天津安仁中医医院，天津300193）

目的研究及优化复方真元颗粒的两次提取工艺。方法以液固比和提取时间为自变量，以干膏率、甘草苷含有量、甘草酸含有量的综合指标作为因变量，采用星点设计-响应面试验设计法，优选两次提取工艺并进行预测分析。

中药复方真元颗粒；星点设计；干膏率；甘草苷；甘草酸

复方真元颗粒是天津安仁中医院根据20余年临床经验，切合肿瘤发病阴阳失衡、真元受损和气虚血瘀为证候核心的基础上，依据甘附汤增扩的有效验方。方中由熟附子（黑顺片）、当归、甘草等9味中药组成，具有散壮火、强少火、平阴阳、清热解毒之功效，临床主要用于肿瘤的辅助治疗，改善肿瘤患者体质，提高机体免疫和生存质量，延长患者寿命。但传统汤剂有诸多缺点，为使其携带和服用方便且能达到相同的药效，首次将其开发成为安全有效、质量可控的颗粒剂。本实验根据处方中每味药材的化学成分和理化性质，结合实际生产特点，采用星点设计-响应面优化法［1-3］，以干浸膏得率及甘草苷和甘草酸的含有量的综合评分为考察指标，优选该制剂的提取工艺。

1　材料

1.1试药甘草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号111610-201106）；甘草酸铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号110731-201116）；乙腈、冰醋酸为色谱纯；无水乙醇为分析纯。

1.2仪器 Lab Alliance高效液相色谱仪（二元高压梯度泵SeriesⅢ、自动进样器As3000、二极管阵列检测器UV6000LP、柱温箱OV2001）；AL2004电子分析天平（梅特勒—托利多仪器有限公司）；Alpha 1-2型冷冻干燥机（德国Christ公司）；N-1100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；PTHW型普通恒温电热套（上海勒顿实业有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；AS-20500BT超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器公司）。

2　方法与结果

2.1甘草苷和甘草酸的测定

2.1.1色谱条件 Apollo C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5μm）；流动相为乙腈（A）-1%醋酸水溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，19%A；8～20 min，19%A→33%A；20～25 min，33%A→50%A；25～30 min，50%A→100% A；30～35 min，100%A→19%A；35～40 min，19%A）；检测波长276 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温30℃；进样量10μL。

2.1.2对照品溶液的制备（1）精密称取甘草苷对照品适量，加70%乙醇溶液制成每1 mL含100μg甘草苷的对照品溶液。（2）精密称取甘草酸铵对照品适量加70%乙醇溶液制成每1 mL含208μg甘草酸铵的对照品溶液（甘草酸质量=甘草酸铵质量/1.020 7）。

2.1.3干浸膏的制备按照处方比例称取药材，加水煎煮得第1次提取液，滤过，浓缩，冷冻干燥，备用；第1次煎煮所得滤渣加水煎煮得第2次提取液，滤过，浓缩，冷冻干燥，备用。

2.1.4供试品溶液的制备精密称取干膏0.075 0 g置于5 mL量瓶中，70%乙醇定容，于40℃下超声混匀40 min，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为甘草苷和甘草酸的供试品溶液。

2.1.5阴性对照溶液的制备按处方比例按“2.1.3”项下方法制备缺甘草的阴性对照溶液。

2.1.6专属性试验按“2.1.1”项下色谱条件进样，分别测定对照品、供试品及阴性对照溶液，结果见图1。

2.1.7线性范围考察精密称取5份质量成倍数的干膏，依照“2.1.4”项下方法，制备供试品溶液，在“2.1.1”项下色谱条件下进行测定，记录峰面积。以供试品溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程为Y甘草苷= 8×108X+483 531（r=0.998 1），Y甘草酸=9×107X+36 992（r=0.999 3），试验结果表明甘草苷质量浓度在16.42～169.9μg/mL，甘草酸质量浓度在0.344～3.562μg/mL范围内具有良好的线性关系。

图1　干浸膏中成分测定HPLC图谱

2.1.8精密度试验按“2.1.1”项下色谱条件，同一供试品溶液连续进样6次，甘草苷和甘草酸峰面积的RSD值分别为1.3%和2.4%，表明精密度良好。

2.1.9稳定性试验按“2.1.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为1.3%和1.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.10重复性试验按“2.1.4”项下方法重复制备供试品溶液6份，按“2.1.1”项下色谱条件进样，甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为0.9%和1.2%，表明该测定方法重复性良好。

2.1.11加样回收率试验取相当于干浸膏0.037 5 g的供试品细粉，平行称定9份，分别置于5 mL量瓶中，按样品中成分含有量80%、100%、120%的比例加入甘草苷和甘草酸对照品各3份，依照“2.1.4”项下方法制备供试品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，由回归方程计算甘草苷和甘草酸量和回收率，甘草苷和甘草酸的平均回收率分别为97.1%和102.6%，RSD值分别为1.9%和2.1%，表明该方法准确度良好。

2.1.12样品测定取干膏适量，平行取样两份，按“2.1.4”项下制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，测定，以外标一点法计算干膏中甘草苷、甘草酸的量，与原药材的比值即为含量。

2.2干膏率的测定精密称定一定量的浸膏，冷冻干燥36 h至恒定质量［4］，置于干燥器中30 min恢复至室温，迅速精密称定质量，按照下式计算干膏率：

2.3提取工艺优选

2.3.1因素及水平考察根据星点设计试验原理、预试验结果和实际生产经验，结合本处方药材的特性，采取水煎提取法，提取次数为两次，每次的考察因素分别为提取时间和液固比。根据星点设计的原理，每因素设五水平，用代码值-α，-1，0，1，α表示，分析因素及水平见表1和表2。

表1　响应面设计第1次提取的因素与水平

表2　响应面设计第2次提取的因素与水平

2.3.2响应面设计根据星点设计法则，按照“2.1.3”项下干浸膏制备工艺，每次试验平行两份，第1、2次提取试验安排及结果见表3和4。为将所有指标综合为一个能反映总体效应结果的值，数据处理采用综合指标（overall desirability，OD）进行直观分析和方差分析。各指标综合评分方程：di=Yi/Ai（di为各指标的评分值，Yi为各指标的实测值，Ai为各指标中相应最大值），以干膏率作为筛选的主要指标，规定其权重系数为0.6，甘草苷和甘草酸的含有量规定其权重系数分别为0.2、0.2［5-7］。

每次试验各指标综合评分方程：

表3　第1次提取试验数据

表4　第2次提取试验数据

2.3.3数学模型拟合及方差分析以OD值为因变量，使用Desgin Expert8.0.6对两次提取各因素进行二次式拟合，Y1、Y2分别为第1、2次提取的拟合方程：

Y1=-206.039 21+35.319 63 A+49.389 07B+ 0.634 54AB-18.229 03A2-2.180 85B2；Y2=-78.572 22-6.823 63A+37.393 73B+5.680 00AB-25.596 00 A2-2.247 25B2；对拟合的方程进行方差分析，结果见表5和6。

表5　第1次提取的方差分析

表6　第2次提取的方差分析

由方差分析可知，两次回归方程的P＜0.05，失拟性检验P＞0.05，相关系数r1=0.809 3，r2=0.851 4，说明方程拟合度良好，该模型准确度较好，可以用该模型对试验结果进行预测。

2.3.4工艺条件优化及预测根据回归方程，作出相应的响应曲面图，见图2和图3。结果表明，两次提取的OD值分别在12倍、1 h和10倍、1 h左右达到最大。结合已建立的数学模型，得到一、二最佳的提取时间和液固比分别是1.09 h、11.41倍；0.91 h、9.40倍。结合实际生产，确定两次提取工艺参数分别为1 h、12倍和1 h、10倍。

图2　第1次提取的提取时间、液固比及其相互作用对提取工艺的影响

图3　第2次提取的提取时间、液固比及其相互作用对提取工艺的影响

2.4工艺验证试验依照最佳工艺条件对第1、2次提取进行3次试验验证，结果分别为：第1次提取干膏率27.72%，甘草苷1.29 mg/g，甘草酸2.69 mg/g，实际总OD值为94.60，与预测值97.29偏差-2.76%；第2次提取干膏率7.65%，甘草苷0.42 mg/g，甘草酸1.08 mg/g，实际总OD值为93.79，与预测值95.02偏差-1.29%，说明所建立的数学模型具有良好的预测性，可用于该复方提取工艺的优化。

3　讨论

3.1抗肿瘤中药真元颗粒原汤剂具有良好的临床效果，熟附子味辛甘，性大热，为补助元阳之主药，有回阳救逆、逐寒燥湿、温助肾阳之功，为君药［8］；当归补血活血，为臣药；甘草补中益气，缓急解毒，调和诸药，解附子之毒为佐药等［9］。现代研究表明，附子多糖、当归多糖、甘草多糖等各味药材水溶性多糖均有不同程度的抗肿瘤功效［10-12］，故采用水煎提取工艺。

3.2本方中熟附子虽为君药，但因其活性成分含有量较少，定量测定方法复杂，故采用测定方法较为成熟的有效成分甘草苷、甘草酸作为评价指标，另由于复方成分复杂，有效成分较多，故亦结合干膏率三者共同作为评价指标，采用OD值对指标进行处理，三者权重分别为0.2、0.2、0.6，较为合理。但由于本方药味较多，试验评价指标仅为三项，并未结合相关药效学研究，因此还需进一步完善。

3.3星点设计-响应面法在试验设计法和结果表达方面较正交试验设计法和均匀设计法更加优良，适宜进行非线性模型拟合，可提高优化预测的精确性，更好地体现各因素、指标与效应值的关系［13-14］。因此，本实验采用星点设计-响应面法优化两次提取工艺，得到最佳条件，为其工业化生产提供了依据。

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