七十味珍珠丸对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑水肿的改善作用

朱敏侠， 戎 浩， 刘晓丽， 王世华， 孙芳云， 李 杨

（西藏民族学院医学院，陕西　咸阳　712082）

七十味珍珠丸对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑水肿的改善作用

朱敏侠， 戎 浩， 刘晓丽， 王世华， 孙芳云， 李 杨

（西藏民族学院医学院，陕西咸阳712082）

目的 观察七十味珍珠丸对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑水肿的改善作用及其分子机制。方法 实验分为假手术组、模型组、溶媒对照组和药物组。七十味珍珠丸每日灌胃1次，预给药7 d后采用大脑中动脉阻塞模型，缺血40 min再灌注24 h，脑含水量测定评估脑水肿程度，Western blot法检测大鼠海马CA1区AQP4蛋白表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠脑水肿明显，AQP4蛋白表达明显升高；而与模型组比较，药物组大鼠脑水肿明显改善，AQP4蛋白表达明显降低。结论 七十味珍珠丸可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤后脑水肿及AQP4蛋白表达。

七十味珍珠丸；脑缺血再灌注损伤；脑水肿；水通道蛋白4

脑卒中是危害中老年人身体健康和生命的主要疾病之一，在2008年卫生部公布的第3次全国死因调查中显示，脑卒中已超过恶性肿瘤成为中国第一致死病因，其高发病率、高死亡率和高致残率给社会和家庭带来沉重的负担［1］。脑卒中包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中，缺血性脑卒中约占87%，其发病原因在于脑的主要供血动脉狭窄或闭塞，疾病发展过程中或后期治疗时局部闭塞的血管再通，从而发生脑缺血再灌注损伤［2］。

藏药七十味珍珠丸（藏文译音为然纳桑培Rannasangpei，简称RNSP），主要由佐太、天然珍珠、天然牛黄、羚羊角、麝香、藏红花等七十余味名贵藏药组成，具有安神、镇静、通经活络、调和气血、醒脑开窍的作用，在脑溢血、脑栓塞、高血压、癫痫、脑卒中等疾病中广为应用［3-4］。七十味珍珠丸对脑缺血保护作用的研究结果显示该药对大脑动脉血栓引起的局部缺血所致的行为障碍有改善作用，减少了脑梗死面积以及脑组织的病理学改变，说明该药对脑缺血有保护作用［5］。本研究拟通过观察七十味珍珠丸对脑水肿的改善作用及分子机制，进一步探讨该药对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

1　材料

1.1动物 44只健康成年雄性Sprague Dawley大鼠（200±20）g，SPF级，由复旦大学上海医学院实验动物中心提供。

1.2药物和试剂 七十味珍珠丸（西藏自治区藏药厂，国药准字Z54020062）。兔抗大鼠水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）抗体（1∶1 000；美国Santa Cruz公司）、小鼠抗大鼠β-actin抗体（1∶5 000；美国Millipore公司）、HRP标记抗兔抗体（1∶1 000；美国Millipore公司）和HRP标记抗小鼠抗体（1∶1 000；美国Millipore公司）。

1.3耗材与仪器 大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型栓线-AAAA级（北京沙东生物技术有限公司）；蛋白质印迹法全套设备（美国Bio-Rad公司）；凝胶成像系统（美国GE公司）；凝胶分析系统（上海复日科技有限公司）。

2　方法

2.1动物预处理给药 大鼠随机分为4组：假手术组（sham）、模型组（MCAO）、溶媒对照组（vehicle+ MCAO）和七十味珍珠丸药物组，简称药物组（RNSP+ MCAO）。将七十味珍珠丸研磨成粉并用蒸馏水稀释（终质量浓度0.1 kg/L），药物组以1 mL/100 g体质量灌胃给药，每日1次，连续7 d，溶媒对照组以蒸馏水灌胃，最后一次灌胃后1 h制作模型。

2.2局灶性脑缺血再灌注模型的制备 MCAO模型是模拟缺血性脑卒中发病机制的首选模型［6］。6%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位，颈部剪毛，常规消毒皮肤后，参照Longa线栓法［7］并加以改进制备大鼠右侧MCAO模型，先分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼颚动脉，结扎颈外动脉远心端，近心端穿线打一松结，血管夹暂时夹闭颈内动脉和翼颚动脉，在颈外动脉远心端结扎线和近心端松结之间剪一小口将栓线插入颈总动脉，拉紧松结的线并将远心端剪断，颈外动脉向颈总动脉方向拉直，经颈内动脉插入栓线，插入长度约18 mm（自颈总动脉分叉处算起），再灌注时拔出栓线并结扎颈外动脉断端。假手术组插入栓线0.5～1 mm，其余操作同模型组。本课题选用缺血40 min再灌注24 h的时间点，再灌注结束后参照Longa评分法［7］进行神经功能缺失评分，1～3分者入选后继实验。

2.3脑含水量测定 大鼠麻醉断头取脑，将左右大脑半球分开，分别放在电子天平上称湿质量，记录。然后置于100℃烘箱中烘烤72 h，称干质量，按照公式计算脑含水量：（脑湿质量-脑干质量）/脑湿质量×100%。各组数据录入计算机，进行统计分析。

2.4蛋白免疫印迹实验（Western blot） 取大鼠右侧海马组织称定质量，加入裂解液匀浆提取上清，测量蛋白浓度，加入等体积2×loading buffer后煮沸5 min作变性处理，然后上样跑电泳。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，以湿转法电转移至PVDF膜上。将PVDF膜置于封闭液中室温孵育2 h后，加入一抗工作液，4℃孵育过夜，TBST洗膜5min×3次后，加入HRP标记的二抗工作液，室温孵育2 h，TBST洗膜5 min，洗3次，ECL显影液加于膜上反应2 min，在凝胶成像系统中选择合适的曝光时间进行显影，图像输入凝胶分析系统进行分析并保存数据。

2.5统计学处理 实验所有数据均以SPSS 17.0软件进行分析，实验数据以±s表示，采用One-Way ANOVA分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3　结果

3.1七十味珍珠丸降低脑含水量 脑缺血再灌注24 h，通过测量脑组织含水量来判断脑水肿情况，缺血侧大脑半球检测结果表明：与假手术组（78.53±0.45）%比，模型组（81.95±0.63）%脑含水量明显增加（P＜0.01）；而与模型组比，药物组（79.16±0.38）%脑含水量减少（P＜0.05）。缺血对侧大脑半球脑含水量在各组间没有明显变化，结果见表1。

表1　缺血对侧和缺血侧大脑半球脑含水量变化（±s，n=6）

表1　缺血对侧和缺血侧大脑半球脑含水量变化（±s，n=6）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05；与溶媒对照组比较，△△P＜0.01

组别缺血对侧大脑半球/%缺血侧大脑半球/%假手术组78.09±0.28 78.53±0.45模型组78.06±0.27 81.95±0.63**溶媒对照组78.41±0.67 82.2±1.13**药物组78.06±0.33 79.16±0.38#△△

3.2七十味珍珠丸减少海马CA1区AQP4蛋白表达 脑缺血再灌注24 h，Western blot检测各组大鼠海马CA1区AQP4蛋白表达，实验结果表明：与假手术组比，模型组（1.25±0.02，P＜0.01）AQP4蛋白表达明显升高；与模型组比，药物组（1.08±0.04，P＜0.01）AQP4蛋白表达下降，结果见图1。

4　讨论

水通道蛋白是一个水选择性通道蛋白家族，目前已从哺乳类动物鉴定出13种水通道蛋白亚型（AQP0-AQP12），它们分布在不同的组织中［8］。AQP4单体分子质量为28 kDa，有1个由6个跨膜结构域构成的水孔，在脑内分布广泛，包括小脑、海马齿状回、海马CA1-CA3区、下丘脑视神经上核和室旁核、新皮层、终纹核和缰核等［9］，而且主要表达在血-脑屏障、血-脑脊液屏障及渗透压感受器的星形胶质细胞足突上，这种分布特点提示它与脑内的水平衡调节存在密切关系，是控制脑实质内外水跨膜转运的主要信号分子［10-11］。

图1　七十味珍珠丸减少MCAO组大鼠海马CA1区AQP4蛋白表达（n=5，±s）

脑水肿分为细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿，前者是由细胞代谢紊乱导致，后者是由血-脑屏障功能障碍及生物大分子降解导致［12］。AQP4在细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿的病理生理机制中非常重要，在细胞毒性脑水肿中，AQP4促进水肿形成，在血管源性脑水肿中，AQP4促进水肿消散［13-15］。大鼠局灶性脑缺血模型可造成细胞毒性脑水肿，造模后24 h，AQP4表达上调并直至造模后第7天，第3天上调最明显，AQP4不仅在缺血中心区表达增多，在缺血周边区域也表达增多，它的增多和脑水肿呈一致性［12，16］，而AQP4敲基因小鼠在脑缺血24 h后的脑水肿减轻、缺血面积和神经缺失体征减少［13］，以上资料表明AQP4是局灶性脑缺血模型造模后参与脑内水转运的主要水通道蛋白。也有临床报道，在脑梗死病人的大脑中，缺血中心区和边缘区AQP4表达均上调［17］。

本课题研究结果显示，模型组大鼠缺血侧脑组织水肿明显，AQP4蛋白表达增高，与模型组比，七十味珍珠丸药物组脑水肿明显减轻，AQP4蛋白表达下降。本研究再次证实了AQP4参与了脑缺血再灌注损伤过程中脑水肿的形成，而七十味珍珠丸预给药可明显减轻脑水肿，减少AQP4蛋白表达，从而对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，也为临床上预防治疗缺血性脑卒中提供了理论依据。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0640-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.040

2014-05-10

西藏自治区科技厅资助项目（2010）；西藏民族学院校级资助科研项目（10myY07）

朱敏侠（1982—），女，博士，讲师，主要从事脑缺血再灌注损伤保护机制的研究。Tel：（029）33755247，E-mail：zhuminxia2001@163.com