胡蓝降糖缓释片影响糖尿病肾病模型大鼠蛋白激酶A与蛋白激酶C活性的实验研究

王 昕， 杨建英， 靳素琴， 吴华清

（1.甘肃中医学院信息工程学院，甘肃　兰州　730000；2.甘肃省疾控中心体检中心，甘肃　兰州　730000）

胡蓝降糖缓释片影响糖尿病肾病模型大鼠蛋白激酶A与蛋白激酶C活性的实验研究

王 昕1， 杨建英2*， 靳素琴2， 吴华清2

（1.甘肃中医学院信息工程学院，甘肃兰州730000；2.甘肃省疾控中心体检中心，甘肃兰州730000）

目的 观察胡蓝降糖缓释片对糖尿病肾病（DN）模型大鼠的治疗作用，检测它对肾脏功能、细胞中蛋白激酶A（PKA）以及蛋白激酶C（PKC）活性的影响，探讨胡蓝降糖缓释片对DN大鼠肾脏治疗作用的可能机制。方法 采用单侧肾脏切除联合腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法制备DN大鼠模型；随机分组，分期检测各组大鼠空腹血糖（FBG）、尿微量白蛋白（mALB），测定大鼠肾皮质细胞中PKA、PKC活性。结果 胡蓝降糖缓释片降低了DN大鼠FBG、24 h-mALB的水平，抑制了PKA、PKC的活化度，肾脏功能得到一定程度的恢复。结论 胡蓝降糖缓释片通过抑制PKA与PKC活化表达度，从而对DN大鼠肾脏起到一定的保护作用。

胡蓝降糖缓释片；糖尿病肾病；蛋白激酶A；蛋白激酶C；实验研究

胡蓝降糖缓释片主要成分从葫芦巴和绞股蓝中提取，在临床应用过程中，对治疗糖尿病肾病（DN）取得了很好的疗效。为阐明其药理作用机理，根据蛋白激酶在肾病理变化过程中的机制理论，设计了胡蓝降糖缓释片对DN模型大鼠作用的实验，以期从PKA、PKC两种激酶的角度出发，论证胡蓝降糖缓释片治疗DN的药理作用机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂与设备 流式细胞仪，血糖仪，PKA、PKC试剂盒，胡蓝降糖缓释片。链脲佐菌素（STZ）购自Sigma公司；兔抗大鼠结缔组织生长因子（CTGF）多克隆抗体及SP免疫试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）。蛋白激酶C（PKC）测定试剂盒购自Gibco公司。

1.1.2实验动物 SPF级雄性（雄性大鼠制造模型的成模率明显高于雌性大鼠）SD大鼠60只（动物合格证号001625），体质量（200±20）g。

1.1.3造模剂 配置链脲佐菌素（STZ）液：柠檬酸缓冲液的配制：柠檬酸2.1 g加入蒸馏水100 mL配成A液；柠檬酸钠2.9 g加入蒸馏水100 mL配成B液。用时A、B液按1∶1的比例混合，pH计测定pH值，调节pH 4.2～4.5，配置成STZ柠檬酸缓冲液。注射时以0.1 g/L柠檬酸缓冲液溶解STZ，按空腹体质量注射相应的STZ，在30 min内注射完毕。

高脂糖饲料：基础鼠饲料加蔗糖、炼猪油以及蛋黄，按比例搭配制作高脂高糖饲料，比例为猪油15%，蔗糖20%，蛋黄4%，基础饲料60%［1］。

1.2造模预实验 取大鼠10只，麻醉后做左侧肾脏切除术，术后恢复2周。给药前禁食12 h，以60 mg/kg的剂量，腹腔内注射0.1 g/L的STZ液。给予高热量饲料喂养。5 d后测定空腹血糖，以16.7 mmol/L作为DN大鼠成模标准。

1.3分组与给药 40只大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、药物对照组（艾塞那肽组）、给药组（胡蓝降糖缓释片组），后3组按预实验可行方案造模。药物对照组给予艾塞那肽注射液，剂量为0.9μg/kg，皮下注射。给药组给予胡蓝降糖缓释片稀释液，给药以灌胃方式进行，剂量为0.15 g/kg，浓度以给药液体量2 mL为标准。空白对照组与模型对照组正常饲养，不给予特殊处理。6周后采集标本检测实验数据。

1.4实验处理

1.4.1空腹血糖（FBG）测定 分别于造模前、注射STZ 5 d后、给药6周末，尾静脉取血，使用血糖仪测定空腹血糖。

1.4.2尿微量白蛋白（mALB）测定 造模前留取尿液标本，应用大鼠尿微量白蛋白放射性免疫分析试剂盒检测尿蛋白水平；取尿液标本，检测尿蛋白水平。

1.4.3肾皮质细胞PKA、PKC活性测定 肾皮质细胞胞液和膜成分的分离：分离肾皮质，每100 mg肾皮质组织加入110 mL缓冲液1（20 mmol/L Tris、0.5 mmol/L EGTA、0.5 mmol/L EDTA、10 mmol/L B-巯基乙醇、0102 5 mg/mL牛胰蛋白酶抑制剂、0102 5 mg/mL亮抑蛋白肽，pH7.5），在冰上充分匀浆，匀浆液于4℃、2 000×g离心15 min，弃沉淀物（去除细胞核、未破碎的细胞及组织）。再于4℃、10 000×g离心60 min，上清液即为胞液成分，用于检测胞液PKC活性。于冰浴中沉淀物用缓冲液2（含015%Triton X-100的缓冲液1，pH 7.5）匀浆，匀浆液于4℃、2 000× g离心15 min，所得上清液即为去污剂溶解的膜制剂，用于检测胞膜PKC活性［1］。

取肾皮质细胞胞液和胞膜制备剂分别用Lowry法进行蛋白定量后，采用PKC试剂盒方法测定胞液和胞膜中PKC活性，底物采用髓鞘碱性蛋白肽MBP4214，PKA、PKC活性以单位时间内每1 mg蛋白质催化ATP的pmoL数表示。

1.5数据分析 应用SPSS 12.0统计软件进行统计分析，结果以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，组间差别的两两比较使用q检验。

2　结果

2.1胡蓝降糖缓释片对DN大鼠FBG的影响 与造模前相比，造模后除空白对照组外，各模型组FBG显著升高，有统计学意义（P＜0.01）。给药6周后，与模型组比较，艾塞那肽组FBG水平显著降低，有统计学意义（P＜0.05），胡蓝降糖片组也呈显著降低，有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　胡蓝降糖缓释片对DN大鼠FBG的影响（±s）

表1　胡蓝降糖缓释片对DN大鼠FBG的影响（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，▲P＜0.05

组别动物数给药剂量FBG/（mmoL·L-1）造模前造模后5 d给药后6周空白对照组10—5.6±1.2 5.8±1.0 4.9±1.6模型对照组10—5.1±1.6 19.3±3.2**18.7±3.2艾塞那肽组10 0.9μg·kg-14.9±1.3 20.4±5.1**11.0±6.5▲胡蓝降糖片组10 0.15 g·kg-14.2±2.4 19.2±4.7**12.6±6.0▲

2.2胡蓝降糖缓释片对DN大鼠尿液24 h-mALB的影响与造模前相比，造模后除空白对照组外，各模型组24 hmALB显著升高，有统计学意义（P＜0.01）；模型对照组与药物治疗组数据分析显示无统计学意义（P＞0.05）。给药6周后，与模型对照组比较，艾塞那肽组24 h-mALB水平显著降低，有统计学意义（P＜0.01）；胡蓝降糖片组24 h-mALB水平也显著降低，有统计学意义（P＜0.05）；与艾塞那肽组比较，胡蓝降糖片组在降低实验大鼠24 hmALB水平方面作用较弱，两种药物治疗后获取的数据存在差异，有统计学意义。见表2。

表2　胡蓝降糖缓释片对DN大鼠尿液24h-m ALB的影响（±s）

表2　胡蓝降糖缓释片对DN大鼠尿液24h-m ALB的影响（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，▲▲P＜0.01；▲P＜0.05

组别动物数给药剂量24 h-mALB/ng造模前造模后给药后6周空白对照组10—92.82±32.42 92.82±32.15 114.71±31.11模型对照组10—98.13±33.35 985.14±115.47**953.11±133.76艾塞那肽组10 0.9μg·kg-190.85±33.26 890.58±130.31**449.57±167.50▲▲胡蓝降糖片组10 0.15g·kg-187.23±29.9 1 043.11±123.82**661.80±69.13▲

2.3胡蓝降糖缓释片对DN大鼠PKA活性的影响 与造模前相比，造模后除空白对照组外，各模型组PKA水平显著升高，有统计学意义（P＜0.05）；模型对照组与药物治疗组相互之间，数据分析显示无统计学意义。给药6周后，与模型对照组比较，艾塞那肽组与胡蓝降糖片组PKA水平显著降低，有统计学意义（P＜0.01）；而两给药组PKA水平数据的差异无统计学意义。见表3。

表3　胡蓝降糖缓释片对DN大鼠肾皮质细胞PKA的影响（±s）

表3　胡蓝降糖缓释片对DN大鼠肾皮质细胞PKA的影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，▲P＜0.05

组别动物数给药剂量PKA/（pmol·min-1·mg-1）造模前造模后给药后6周空白对照组10—617.6±43.1 625.4±41.8 622.6±56.3模型对照组10—626.7±52.4 853.3±57.6*836.9±34.7艾塞那肽组10 0.9μg·kg-1624.8±44.3 821.1±48.2*499.7±43.2▲胡蓝降糖片组10 0.15 g·kg-1611.2±54.4 819.4±49.5*509.4±55.2▲

2.4胡蓝降糖缓释片对DN大鼠PKC活性的影响 与造模前相比，造模后除空白对照组外，各模型组PKC水平显著升高，有统计学意义（P＜0.01）；模型对照组与药物治疗组相互之间，数据分析显示无统计学意义。给药6周后，与模型对照组比较，艾塞那肽组与胡蓝降糖片组PKC水平显著降低，有统计学意义（P＜0.05）；而两给药组PKC水平数据的差异无统计学意义。见表4。

表4　胡蓝降糖缓释片对DN大鼠肾皮质细胞PKC的影响（±s）

表4　胡蓝降糖缓释片对DN大鼠肾皮质细胞PKC的影响（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，▲P＜0.05

组别动物数给药剂量PKC/（pmol·min-1·mg-1）造模前造模后给药后6周空白对照组10—80.1±11.2 85.8±7.6 85.8±7.6模型对照组10—79.2±8.4 368.7±24.9**376.7±36.8艾塞那肽组10 0.9μg·kg-184.1±9.5 375.4±41.5**231.6±15.7▲胡蓝降糖片组10 0.15 g·kg-183.5±8.5 382.5±45.3**248.4±21.3▲

3　讨论

研究显示，糖尿病大鼠肾脏NOX4和p22phox mRNA表达水平显著升高，导致糖尿病大鼠肾脏氧化应激水平升高，作用于糖尿病大鼠肾脏而引起肾组织损伤，进一步导致肾脏结缔组织生长因子（CTGF）蛋白表达增加，肾脏肥大指数和尿白蛋白增加，肾脏病理改变加重［2］。糖尿病情况下存在明显的氧化应激反应增强，参与氧化应激机制的因素很多，PKC处于被激活的状态［3］。我们在研究胡蓝降糖缓释片药理作用机制时，选择PKA作为总的蛋白激酶活性的指标；选择PKC作为特异性较强的指标，体现药物作用下激酶反应的明确指征。DN患者尿蛋白水平与血中PKC水平成正相关，动物试验证实，PKC-β基因的敲出和利用双吲哚基顺丁烯二酰亚胺阻滞PKC相关信号通路，均可使DN动物免受肾脏肥大、肾小球高滤过、ECM沉积、结缔组织生长因子（CTGF）、TGF-β1和活性氧生成所造成的危害［4］。PKC的激活与TGF-β1的生成，可以上调细胞黏附分子在肾小球系膜细胞中的表达和促进肾小球白细胞的浸润，加速肾小球损伤［5］。

艾塞那肽是人工合成的GLP-1受体激动剂，通过与其受体特异性结合发挥作用［6］。是肠促胰素类似物药物，可模拟人体自身胰高糖素样肽1（GLP-1）的功能，降低健康受试者和2型糖尿病患者的体质量、空腹和餐后血糖，降低糖化血红蛋白，同时促进胰岛β细胞新生、增殖，抑制β细胞凋亡，改善β细胞功能，促进胰岛素分泌，增加机体对胰岛素的敏感性［7］。可以作为很好的对照药物应用于实验。

胡蓝降糖缓释片主要药物是葫芦巴和绞股蓝。葫芦巴苦、温，归肾经，温肾助阳、散寒止痛。鉴定出26种化合物，其中胺类、酸类、醇类、酯类、酮类，分别占挥发油含有量的0.54%、0.18%、66.32%、12.13%与0.61%［8］。绞股蓝苦、微甘，性凉，归肺、脾、肾经；能益气健脾、化痰止咳、清热解毒，可降低血压、血脂、血糖。绞股蓝对2型糖尿病大鼠肾脏纤维化有保护作用，可能是通过下调大鼠肾组织TIMP-1和上调MMP-9的表达来实现的［9］。葫芦巴联合缬沙坦不但可明显减少蛋白尿而且有助于控制血糖，可作为治疗糖尿病肾病的一种选择［10］。葫芦巴和绞股蓝配伍应用于治疗DN，药物气味入归肾经，在温补肾气的同时，清化痰瘀邪气对肾脏的侵害。DN病理过程起因于血液糖浓度的增加，后因于高糖这种痰浊而导致肾脏气血失畅，以致出现慢性劳损性肾脏功能的损害。针对这种病理特点，治疗的出发点就应该是补肾以促进肾脏功能的回复、化痰祛瘀以祛除病因对肾脏的继续损伤。从病理学方面说，就是要改善肾脏血流、减少尿蛋白，以及防治肾脏纤维化［11］。绞股蓝健脾清气化痰、葫芦巴温肾助阳，二者相合正好能适合治疗特点的要求，所以在临床上能有好的治疗效果。

实验显示DN模型大鼠肾功能经胡蓝降糖缓释片治疗出现改善的状态，而相对应的肾皮质细胞蛋白激酶的变化特点提示，胡蓝降糖缓释片可以影响到分子层面的药理作用环节，而这种药理作用途径正是确认和有效把握药物制剂临床使用的可靠途径。高糖条件下，PKC激活可以增加MC的NO产生，从而使血管扩张，肾血流增加，肾小球高滤过，导致早期DN［12］；细胞膜PKC活性增加，胞浆活性下降，提示高糖可引起肾小球细胞内PKC由胞浆向胞膜移位活化［13］。通过影响DN大鼠肾组织分子的表达而改善生化指标，减轻肾脏病理损害［14］，是实验研究的方法性前提。实验为胡蓝降糖缓释片治疗DN药理机制的阐释铺陈了一定的基础。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0637-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.039

2014-02-07

甘肃省中医药管理局科研项目（GZK-2012-59）

王 昕（1970—），男，讲师，研究方向为中药资源与质量控制。Tel：（0931）8765365

杨建英（1965—），女，副检验师。Tel：（0931）8271733