促渗剂对三七中人参皂苷Rh1体外透皮的影响
2015-10-18王承潇杨晓艳崔秀明
张 定， 王承潇， 杨晓艳， 崔秀明
（昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）
［制 剂］
促渗剂对三七中人参皂苷Rh1体外透皮的影响
张 定， 王承潇， 杨晓艳， 崔秀明*
（昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650500）
目的 研究三七中人参皂苷Rh1的理化性质及其体外透皮性能。方法 采用摇瓶法测定人参皂苷Rh1的表观溶解度和油/水分配系数；采用体外扩散池法测定小鼠皮和猪皮对Rh1体外经皮渗透系数以及对不同促渗剂和质量浓度对其体外经皮促渗效果；并采用高效液相色谱法对人参皂苷Rh1进行分析。结果 人参皂苷Rh1的表观溶解度为（60.70±3.21）μg/mL，其油水分配系数lg P值为2.49±0.04，人参皂苷Rh1在小鼠皮上的经皮吸收性能强于猪皮，促渗剂对人参皂苷Rh1的透皮能力大小为：5%N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）＞5%丙二醇（PG）＞5%氮酮（AZ）＞5%油酸（OA）；不同质量浓度的促渗剂促渗能力大小为1%NMP＞3%NMP＞5%NMP和1%PG＞3%PG＞5%PG。结论 人参皂苷Rh1在小鼠皮肤上具有更强通透性，且1%NMP和1%PG可作为人参皂苷Rh1经皮吸收的促渗剂。
人参皂苷Rh1；三七；经皮渗透；促渗剂
三七为人参属五加科植物Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen，以根部入药，具有散瘀止血，消肿定痛之功效［1］。三七总皂苷是三七主要有效部分，其药理活性得到了深入的研究和报道。人参皂苷Rh1是一种稀有人参皂苷，在总皂苷中的含有量不足0.1%。近年来，人参皂苷Rh1在抗肿瘤、修复细胞损伤、消炎镇痛以及促使子宫内膜发育等方面表现出了良好的生理活性［2-4］，而受到了越来越多的关注和重视。
在经口服给药后，人参皂苷Rh1的生物利用度仅为1.01%，且血液消除速率较快［5］，这些不利因素限制了人参皂苷Rh1作为活性药用成分的进一步开发和利用。因此，改变三七皂苷给药途径，对提高药物的体内吸收，增强药物疗效，具有显著意义。透皮吸收制剂是无创伤性给药途径，能避免口服给药所产生的首过效应及静脉注射所带来的顺应性差等缺点，提高药物生物利用度，降低毒副作用［6-7］。然而到目前为止，尚未有针对人参皂苷Rh1体外透皮性能研究的文献报道，本实验系统地研究人参皂苷Rh1体外经皮渗透特性，为人参皂苷Rh1的制剂设计提供理论依据。
1 材料与仪器
1.1仪器 CP114电子分析天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；日本岛津LC-20AB型高效液相色谱仪；YB-P6智能透皮试验仪（天津天光光学仪器有限公司）；TDZS-WS台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；ZWY-111B恒温振荡培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）。
1.2试药与试剂 人参皂苷Rh1对照品（阿拉丁试剂（上海）有限公司，结构式见图1［8］）；人参皂苷Rh1原料药（昆明理工大学生药学研究组提供，纯度＞95%）；水溶性月桂氮艹卓酮（azone，AZ）（砀山县胜龙精细化工有限公司）；N-甲基-2-吡咯烷酮（N-methyl-2-pyrrolidone，NMP）（西陇化工股份有限公司）；油酸（oleic acid，OA）、1，2-丙二醇（propylene glycol，PG）（天津市致远化学试剂有限公司）；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；水为二次蒸馏水。
1.3实验动物 昆明种小鼠，体质量（20±2）g，雌雄各半，昆明医科大学实验动物房提供；猪，体质量（10±2）kg，雄，购于当地屠宰场。
图1 人参皂苷Rh1化学结构式Fig.1 Chem ical formula of ginsenoside Rh1
2 方法与结果
2.1人参皂苷Rh1成分测定HPLC方法学的建立
2.1.1色谱条件 Vision C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱（0～12 min，35%→38%乙腈；12～13 min，38%→35%乙腈）；体积流量1 mL/min；检测波长203 nm；进样量10μL；柱温40℃。
试验表明小鼠皮和猪皮对人参皂苷Rh1的透皮吸收均无干扰，见图2。
图2 高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms
2.1.2标准曲线绘制 精密称取人参皂苷Rh1对照品5 mg，用甲醇配制成质量浓度为1 mg/mL的对照品贮备液，取贮备液适量分别制成0.2、0.4、2、6、10、30、50μg/mL，0.45μm微孔滤膜过滤，注入HPLC仪测定，以对照品质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=11 807C+1.4×10-5，r= 0.999 4。结果表明人参皂苷Rh1在0.2～50 μg/mL与峰面积的线性关系良好。
2.1.3精密度试验 精密吸取线性范围的样品50 μg/mL 20μL，在上述色谱条件下连续进样6次，测定峰面积，计算相对标准偏差，其值为0.32%，结果表明该方法的精密度良好。
2.1.4重复性试验 取5份不同的供试品溶液进行进样，测定峰面积，计算得其RSD值为1.12%，表明本方法的重复性良好。
2.1.5回收率试验 取一定量的人参皂苷Rh1对照品溶液，加入到12 h空白皮肤渗透液中，制成低中高质量浓度分别为0.4、10、50μg/mL系列溶液，并按照“2.1.1”项色谱条件进样，测定峰面积并计算其平均回收率为96.75%，其结果见表1。
表1 人参皂苷Rh1回收率结果Tab.1 Results of recovery tests for ginsenoside Rh1
2.2人参皂苷Rh1表观溶解度的测定 称取过量的人参皂苷Rh1原料药，加入超纯水25 mL，超声30 min，配制过饱和溶液，并于36.5℃条件下350 r/min搅拌24 h后，使达到饱和状态；量取4 mL上述溶液4份，离心（5 min，3 000 r/min），各取上清液1 mL，0.45μm微孔滤膜过滤，经适当稀释，HPLC测定，计算得到的人参皂苷Rh1表观溶解度为（60.70±3.21）μg/mL。
2.3人参皂苷Rh1油/水分配系数测定 用正辛醇饱和的水溶液配置成0.065 mg/mL的人参皂苷Rh1溶液，精密移取10 mL，加入10 mL正辛醇（预先用水饱和），混匀，超声5 min，并于37℃摇床中避光振摇24 h，静置至溶液分层，从各底部取其水相中的溶液1 mL，按照“2.1”项中的HPLC法测定人参皂苷Rh1在水相中的质量浓度，根据公式1计算得出lg P值为2.49±0.04。
其中C0为人参皂苷Rh1在水相中原有的质量浓度，Cw为平衡后人参皂苷Rh1在水相中质量浓度。
2.4人参皂苷Rh1体外透皮吸收性能考察
2.4.1离体小鼠腹部和猪耳背皮肤的制备 取小鼠剪去腹部毛发，处死后剥离腹部皮肤，去除皮下脂肪及结缔组织，用生理盐水反复冲洗干净，置于-20℃冰箱保存备用。由于猪皮的通透性和人皮接近，因此另取猪耳背皮肤一块，去除皮下脂肪、组织及毛细血管，用生理盐水洗净，同样置于-20℃冰箱保存备用。
2.4.2供试药液制备 取0.50 g的人参皂苷Rh1原料药，用水溶解配制成饱和供试药液。
2.4.3人参皂苷Rh1在不同皮肤模型中的体外透皮实验 实验时先将小鼠皮和猪皮在室温下自然解冻，用生理盐水洗净，滤纸吸干表面水分，将处理好的皮肤固定于扩散装置的中间，使角质层面向释放池，用配套钢夹夹稳；在供给池中加入1 mL的供试药液或1 mL的超纯水（阴性干扰试验），池顶覆以铝箔纸，在接收池中加入15 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）溶液作为接收液，使皮肤与接收液充分接触，池内水温36.5℃，恒温磁力搅拌。加样后平衡30 min后开始计时，于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h从样品接收池中取出1 mL，同时补加等量同温的接收液至接收池，取出的接收液样品经0.45μm微孔滤膜过滤，用HPLC法测定药物含量，按公式（2）、（3）［9］计算单位面积累计渗透量Q（μg/mL）、渗透系数Pm（cm/h），结果见表2～3。
其中，Cn、Ci为第n个和第i个取样点测得的药物质量浓度；Vo为扩散池体积15.0 mL；Vi为每次取样的体积1.0 mL；A为皮肤扩散面积1.327 cm2；
其中，J（μg·cm-2·h-1）为稳态透皮速率，由药物累积经皮透过量-时间曲线（图3）直线部分斜率可得；C为供给池药物浓度。
2.4.4药物皮内滞留量的测定 透皮实验结束后，取下离体皮肤，剪下用药部位，分别用清水和无水乙醇擦拭皮肤表面各3次，以除去离体皮肤表面残留药物，用滤纸吸干水分后，将皮肤剪碎，置于15 mL离心管中，加甲醇1mL旋涡5min后超声提取1 h，离心15 min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，用HPLC进行测定，按照公式4计算药物在皮肤中的滞留量Qm。
其中Cm为测得残留皮肤内药物质量浓度，V为加入甲醇的体积，A为皮肤渗透面积。
表2 人参皂苷Rh1在不同皮肤模型的经皮渗透参数（n=3）Tab.2 Transdermal parameters of ginsenoside Rh1on differentmodel skins（n=3）
图3 人参皂苷Rh1在不同皮肤模型的经皮吸收特征Fig.3 Transdermal absorption profiles of ginsenoside Rh1on differentmodel skins
由图3可知，小鼠皮和猪皮人参皂苷Rh1在0～12 h内的透皮吸收均呈零级动力学规律。对比表2中各种参数可知，人参皂苷Rh1在小鼠皮中的稳态透皮流量要显著高于猪耳背皮肤，12 h累积透过量Q12也显著高于猪耳背皮肤。在小鼠和猪皮的经皮吸收中均观察到不同程度的时滞；而药物在不同皮肤模型上的皮肤滞留量大小为：猪皮＞小鼠皮。
2.5不同促渗剂对Rh1经皮促渗作用考察 取一定量“2.4.2”项的供试药液，精密加入适量不同促渗剂，配制成质量浓度一定的供药溶液。采用小鼠皮肤按照“2.4.3”项方法进行体外透皮试验，考察不同促渗剂对药物经皮吸收的促渗作用，其中增渗比（ER）为加入不同促渗剂的人参皂苷Rh1稳态流量与对照组的比值，结果见表3和图4。
表3 不同促渗剂的人参皂苷Rh1在小鼠皮上的透皮结果（n=3）Tab.3 Transdermal amounts of ginsenoside Rh1w ith different enhancers on m ice skins（n=3）
图4 不同促渗剂对人参皂苷Rh1的经皮吸收特征Fig.4 Transdermal absorption profiles of ginsenoside Rh1w ith different enhancers
由图4可知，含有不同促渗剂的人参皂苷Rh1体外透皮释药符合零级方程；从表3可知，与对照组相比，OA对人参皂苷Rh1无显著经皮促渗作用；AZ、NMP、PG均对人参皂苷Rh1有不同程度的促进作用；其中NMP和PG对人参皂苷Rh1有显著的透皮作用（P＜0.05），ER分别达到4.43和3.32，各组促渗剂对人参皂苷Rh1的促渗能力大小为5%NMP＞5%PG＞5%AZ＞5%OA；皮肤滞留量大小为5%NMP＞5%AZ＞5%PG＞5%OA。
2.6促渗剂浓度对Rh1经皮促渗作用影响考察取一定量“2.4.2”项的供试药液，精密加入不同浓度NMP和PG试剂，配制成供药溶液。采用小鼠皮肤按照“2.4.3”项方法进行体外透皮试验，考察不同浓度促渗剂对药物经皮吸收的促渗作用，结果见表4和图5。
表4 含不同浓度促渗剂的人参皂苷Rh1在小鼠皮上的透皮结果（n=3）Tab.4 Transdermal results of ginsenoside Rh1w ith different concentrations of enhancers on m ice skin（n=3）
图5 不同浓度NMP对人参皂苷Rh1经皮吸收影响Fig.5 Transdermal absorption profiles of ginsenoside Rh1w ith different concentrations of NMP
图6 不同浓度PG对人参皂苷Rh1的经皮吸收影响Fig.6 Transdermal absorption profiles of ginsenoside Rh1w ith different PG concentrations
由表4可知，不同浓度的NMP促渗剂对人参皂苷Rh1均有明显的促渗作用，其促渗能力大小为1%NMP＞3%NMP＞5%NMP，增渗数分别为6.33、5.06、4.43；人参皂苷Rh1的皮肤滞留量大小为1%NMP＞5%NMP＞3%NMP。不同浓度的PG对人参皂苷Rh1也均有明显的促渗作用，其促渗能力大小为1%PG＞3%PG＞5%PG，增渗倍数分别为7.05、6.37、3.32；人参皂苷Rh1的皮肤滞留量大小为1%PG＞3%PG＞5%PG。结合图5、图6可知，随着促渗剂浓度的增大，其对人参皂苷Rh1的促渗能力逐渐减弱。
3 讨论
由“2.2”项和“2.3”项考察结果可知，人参皂苷Rh1表观溶解度为60.70μg/mL，说明人参皂苷Rh1具有一定的水溶性。lgP值反映了分子在生物膜中跨膜转运的特性：lgP值越大，物质对生物膜的渗透作用越强。一般lgP值接近于3，药物易透过皮肤屏障［9］。人参皂苷Rh1的lgP值为2.488，亲油性好，具有一定的经皮吸收能力。而另一方面，人参皂苷Rh1熔点较高，为192～194℃，相对分子质量较大，为638.87（图1），而高熔点不利于药物体外经皮吸收［10］。上述理化参数综合作用提示着人参皂苷Rh1具有一定程度的皮肤渗透能力，但是渗透作用受到高分子量和高熔点的限制。
由“2.4”项的考察结果可知，人参皂苷Rh1在小鼠皮和猪皮中均表现出不同程度的透皮吸收能力。人参皂苷Rh1在小鼠皮中具有更强的经皮渗透作用，这与文献［11-12］对小鼠皮和猪皮的体外经皮吸收性能的考察结果是一致的。一方面，由于角质层中的角质细胞间类脂与角质细胞一起形成致密的组织，水分子等其他物质难通过，是药物经皮吸收的主要屏障［11］；据文献报道猪皮的角质层的平均厚度约为（26.4±0.4）μm，而小鼠的约为（5.8±0.3）μm［13］，猪皮的角质层比小鼠皮的厚，导致药物难从猪皮的角质层中渗透进去。另一方面，从药物的渗透系数Pm也可以看出来，Pm只与皮肤和药物的性质有关，其值越大，表示药物透过皮肤越容易［9］；且药物经小鼠皮吸收的时滞较小，皮肤滞留量相对较低，比起猪皮更易于药物的渗透。
由“3.1”和“3.2”项的讨论可知，尽管人参皂苷Rh1在小鼠皮中有一定的通透性，但通透性较低，因此有必要对经皮吸收促渗剂进行考察。本研究以人参皂苷Rh1的累计透过量为主要指标，筛选了4种促渗剂。“2.5”项考察结果可知，NMP和PG对人参皂苷Rh1表现出显著的经皮促渗作用；从药物皮肤滞留量考察结果可知，和其他促渗剂相比，NMP显著增加了人参皂苷Rh1皮内滞留量。说明NMP通过改变药物在角质层中的溶解性和分配性，增加药物在角质层中的蓄积，促使药物在角质层内形成药物贮库。药物在皮肤-接受液中的浓度梯度变大，促进药物从角质层持续不断地释放，对药物产生促渗作用［14］。
由“2.6”项的考察结果可知，不同浓度的NMP和PG对人参皂苷Rh1的促渗作用均随着浓度的增大而减小。与对照组相比，加入1%NMP和1%的PG促渗剂后，人参皂苷Rh1的累计渗透量和滞留量在小鼠皮肤内均最大，其累计渗透量分别达到100.84和116.74μg/cm2，这说明NMP和PG作为促渗剂有最佳的使用浓度范围，1%的促渗剂对人参皂苷Rh1具有更好的经皮渗透能力。
4 结论
本实验对三七中稀有人参皂苷Rh1的经皮渗透吸收特性进行了系统评估。研究发现，人参皂苷Rh1具有一定的水溶性和跨膜吸收能力，在小鼠皮和猪皮中都表现出了不同程度的经皮通透性。实验考察了几种常用促渗剂的促渗效果，结果显示NMP和PG对Rh1具有较好的渗透作用。ER值分别为6.33和7.05，在此基础上，对促渗剂的浓度进行了考察，发现在低浓度下（1%），NMP和PG均具有较好的促渗效果。本研究为人参皂苷Rh1外用给药体系的开发提供了理论基础和实验依据，为三七新型制剂设计提供了新的研究思路。
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Influence of penetration enhancers on transdermal delivery of ginsenoside Rh1from Panax notoginseng
ZHANG Ding， WANG Cheng-xiao， YANG Xiao-yan， CUIXiu-ming*
（1.School of Life Science and Technology，Kunming Uniυersity of Science and Technology，Kunming 650500，China）
AIM To study the physical and chemical properties and inυitro transdermal delivery of ginsenoside Rh1from Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen.METHODS Shake-flask method was applied to determining the apparent solubility and oil/water partition coefficient of ginsenoside Rh1.Inυitro skin permeation was conducted bymeans of Franz diffusion cellwith pigs'and mice's skin asmodels.Transdermal absorption profiles of different species and concentrations of penetration enhancers were investigated and the HPLC analyses were performed.RESULTS The apparent solubility of ginsenoside Rh1was（60.70±3.21）μg/mLwith an apparentoil/ water partition coefficient of 2.49±0.04.The mice's skin transdermal absorption was better than that of the pigs'.NMP showed that the best skin enhancementwas produced by PG，AZ and OA.Concentrations of enhancers were inverse related to the skin enhancement.The order of the permeation influencewas kept as：5%N-methyl-2-pyrrolidone（NMP）＞5%propylene glycol（PG）＞5%azone（AZ）＞5%oleic acid（OA），while the order of the enhancer concentrations in change to the transdermal delivery was 1%NMP＞3%NMP＞5%NMP，and 1%PG＞3%PG＞5%PG.CONCLUSION Ginsenoside Rh1can penetrate easily through mice's skin，and 1% NMP and 1%PG ensures the best penetration of ginsenosides Rh1.
ginsenoside Rh1；Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen；transdermal delivery；penetration enhancer
R969.1
A
1001-1528（2015）03-0511-07
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.011
2014-07-12
张 定（1989—），女，硕士生，研究方向为中药新剂型。E-mail：18388456194@163.com
崔秀明（1963—），男，博士生导师，研究员，研究方向为云南省道地药材研究与开发。Tel：（0871）65937275，E-mail：sanqi37@vip.sina.com
