桑树细菌性枯萎病菌的PCR检测技术研究＊

王 芳 ，谢关林 ，邹珍友 ，汤佳美 ，蔡 静 ，倪梦洁 ，黄 洁

（1.新县茶产业办公室，河南 信阳 465500；2.浙江大学 植物保护系 农业部病虫分子生物学开放重点实验室，浙江 杭州 310029；3.台州学院 医学院 医学检验系，浙江 台州 318000）

0 引言

2006年上半年在浙江杭州地区发现一严重的桑树细菌性“枯萎”病害，幼龄桑发病初期由枝条上叶片开始呈失水状，继而全株叶片凋萎、枯焦，直至脱落；剥开主干皮层，可见木质部褐色条状斑；病株根部外观正常，但木质部严重变褐，在夏伐整枝后出现大批枯死现象。从桑园的发病情况与病株的症状看，与桑青枯菌（Ralstonia solanacearum）较为相似。但最大的不同之处是该病一般始于桑树下部叶片，幼桑上尤为明显，病叶“枯萎”后由下而上脱落，造成光杆。经细菌学、电镜观察、致病性及Kock氏假说测定、Biolog鉴定、脂肪酸分析、生理生化、ERIC-PCR分析、16S rRNA序列分析及与肠杆菌属（Enterobacter）中与植物有关的7个模式种菌株和其他3株参考菌株的比较，确认桑“枯萎”病为肠杆菌属中新种所引起［1-2］。文献［3］将这一病原新种命名为Enterobacter mori。在桑树细菌病害中由Ralstonia solanacearum引起的桑青枯病是国内外研究较多的［4-7］，对病原的检测已有较成熟的分子检测方法［8］，但到目前为止，由Enterobacter mori引起的桑细菌性枯萎病菌国内外尚无分子检测的报道。

虽然桑青枯与桑枯萎同属细菌，症状又很相似，但青枯菌分子方法无法检测到桑枯萎菌。本研究的目的是建立一种新的PCR检测方法，直接用于田间样品的E.mori菌检测，即采用组织浸出液的方式来对样品进行检测，无需进行病原菌的分离和DNA提取即能快速地检测到枯萎菌，以阻止该病菌的进一步蔓延。

1 材料与方法

1.1 桑细菌性枯萎菌的分离

从桑树种植大省浙江和广西染病的桑树上分离到96株桑枯萎菌株［2］，从这96株桑枯萎菌株中选取其中的4个作为代表菌株用于进一步的研究。以本实验室保存的青枯菌syringae pv.mori（桑疫病菌）、肠杆菌属的9个模式菌株和其他7个病原菌作为桑树枯萎菌的PCR检测对照。

1.2 DNA的提取

挑取单菌落接种到NA培养基上，30℃培养。用细菌全基因组抽提试剂盒进行DNA的提取。DNA浓度控制在。85μg/mL～95μg/mL。

1.3 菌悬液的制备

挑取NA平板上的单菌落于1mL蒸馏水中，制成1×109cfu/mL的菌悬液，经梯度稀释后，制成1×109cfu/mL～1×100cfu/mL各个浓度梯度的菌悬液，待用。

1.4 测序及引物的设计

通过测定E.mori的部分ropB基因片段及其相近种和只存在于E.mori中的特定区间的基因序列，然后根据RNA聚合酶的ropB基因设计能用于E.mori检测的特异性引物。

PCR 反应采用的体系为:1μL 模板，5μL10×PCR Buffer，0.25μLTaq 酶，20 mM dNTP 0.25μL，0.2μM CM7和 CM31b引 物［9］。 引 物 序 列 为 :CM7:AACCAGTTCCGCGTTGGCCTGG；CM31b:CCTGAACAACACGCTCGGA。

反应程序为:95℃变性 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，35 个循环；72℃延伸 5min。PCR 产物由中国BGI公司测序。用ClustalW［10］和Genbank中的一些序列比对后，发现两个特异性区间:Em-ropBF:GCCAAGCCGATTTCTGGAGCA

Em-ropBR:CGTTTCGATTGGACATACG

因此，我们将这对区间作为检测E.mori的引物。

用PCR和real-time PCR分析E.mori检测的条件，即通过设置退火温度梯度来确定PCR检测E.mori的合适反应条件。

1.5 引物的特异性及检测灵敏度分析

通过扩增表1中所列的菌株分析引物的特异性。分别用梯度稀释的E.mori DNA和梯度稀释的菌悬液作为PCR模板测试引物的灵敏度。

1.6 桑树疑似枯萎病样品的检测

1.6.1 桑树样本材料的制备

采集浙江省杭州市临安、桐庐和淳安的桑树枯萎病疑似病株，剪取发病植株根和茎，用75%乙醇消毒30s，然后用无菌水冲洗3次，剪碎置于1.5mL eppendorf管中，注入约l mL无菌水，120r/min，室温培养30min。浸液2000r/min离心10min，然后转移到新的1.5mL离心管中并8000r/min离心20min，小的片段重悬于30μL无菌水中，即为样品浸出液，可直接作为PCR模板用于进一步的分析。

1.6.2 桑树样本的检测

以浸出液为模板，并以Em-ropBF和Em-ropBR为引物进行PCR扩增。PCR反应采用的体系为:2μL 模板，2.5μL 10×PCR Buffer，0.15μL Taq 酶，20 mM dNTP 0.15μL，0.2μM Em-ropBF 和 Em-ropBR引物，反应程序为:95℃变性 5min；95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，40 个循环；72℃延伸 5min。

2 结果

2.1 PCR分析的特异性和灵敏度

检测结果表明，96株桑细菌性枯萎病菌株以Em-ropBF和Em-ropBR为引物均可以扩增出307bp的片段，其他菌株均不能扩增出条带，结果见表1。

由普通PCR法和RT-PCR来确定这对引物的灵敏度［11］。并验证了这对引物具有较高的灵敏度。当DNA浓度在10pg/μL或者菌悬液浓度在104-5cfu/mL时，即可以通过常规PCR的方法检测到病原菌。

表1 桑细菌性枯萎病病原与其他相近菌株的PCR测定结果Table.1 The PCR results of E.mori and other related pathogenic bacteria

2.2 桑细菌性枯萎病实际样本的检测

用Em-ropBF和Em-ropBR引物对采集自杭州地区桐庐、临安和淳安的44份桑树疑似病害样品进行检测，PCR扩增结果如表2，淳安样品中只有样品35检测到了E.mori，在此只列出了了临安，桐庐样品的电泳图，见图1。桑细菌性枯萎病菌E.moris主要存在于桐庐的11份样本和临安的7份样本中，一些萎蔫样本未检测到病原细菌，同时经镜检后也没有发现喷菌现象，可能是由非生物因子引起。

图1 部分杭州临安、桐庐桑树样品中E.mori的检测电泳图Fig.1 DNA biding patterns after specific amplification of ropB regions

表2 浙江杭州地区桑树枯萎病疑似病害样品检测结果Table.2 Detection results of the MWD samples from Hangzhou region

3 讨论

3.1 引物的设计

ropB基因是编码RNA聚合酶Beta亚单位的一个基因，广泛存在于细菌当中［12］，这个基因多被应用于肠杆菌的分类当中［13］。尽管所有细菌中都存在这个基因，但是我们仍然可以根据这个基因的保守序列来设计特异性引物。我们根据ropB基因序列和E.mori代表菌株系列的比对发现了两个特异区间，Em-ropBF和Em-ropBR，即检测E.mori的特异性引物。

我们选取了一系列的菌株验证了这对引物的特异性，从浙江和广西染病的桑树上分离到的96株桑枯萎菌株，以青枯菌、桑疫病菌、肠杆菌属的9个模式菌株及本实验室的其他7个病原菌为对照，分离到的枯萎菌在307bp处出现一明显条带，其他菌均没有条带出现，证明这对引物具有较高的特异性。近年来，各种Real-time PCR方法被广泛应用于病原菌的检测中，具有很好的效果［14］，本研究用Real-time PCR的方法验证了这对引物具有较高的灵敏度。

3.2 对田间桑树枯萎病疑似病害样品的检测

在本研究中，我们用一种快速而有效地方法用于田间样品检测。以前的报道中对样品的检测主要集中在用一些方法提取DNA后进行检测，如PVP法［15-16］。提取DNA后，样品的纯度更高，所以可能会提高PCR检测的灵敏度。但是这里我们直接采用浸出液作为PCR模板，无需进行病原菌的分离和DNA提取就能直接进行样品检测。在对桑枯萎菌的分析检测中，对采自杭州地区桐庐、临安和淳安的样品茎和根均做组织浸出液并以枯萎菌引物对组织浸出液进行PCR扩增和电泳检测。对临安、桐庐和淳安的样品鉴定显示，较多样品在307bp处出现明显的条带。在同一样品的检测中我们发现，其浸出液的菌量分布不均匀，在进样时必须特别注意。同时还发现，同一株发病较轻的桑树，其茎杆上无法检测到病原菌，但根部往往容易检测到，这表明桑枯萎菌主要存在于根部。

［1］Wang G F,Praphat K,Xie G L,Zhu B.Bacterial wilt of mulberry （Morus alba） caused by Enterobacter cloacae in China［J］.Plant Disease,2008,92（3）:483

［2］Wang G F,Xie G L,Zhu B,et al.Identification and characterization of the Enterobacter complex causing mulberry （Morus alba）wilt disease in China［J］.Europe Journal of Plant Pathology,2010,126（4）:465-478

［3］Zhu B,Lou M M,Xie G L,et al.Enterobacter mori sp.nov.,a novel Enterobacter species associated with bacterial wilt on Morus alba L［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2011（61）:2769-2774.

［4］朱燕,叶志毅，吕志强，等.桑树青枯病的分布危害和防治的研究进展［J］.蚕桑通报,2005,36（1）:6-9.

［5］徐丽慧,徐福寿，李芳，等.桑细菌性青枯病病原及其生化型鉴定［J］.植物保护学报,2007,4（2）:141-146.

［6］王国芬,谢关林，徐福寿，等.桑青枯病描述及研究中的几个问题探讨［J］.蚕业科学,2007,33（2）:321-324.

［7］毛铿祖.广东桑青枯病的发生与防治［J］.中国蚕业,1996,4:19-20

［8］Ito S,Ushuima Y,T Fujii,et al.Detection of Viable Cells of Ralstonia solanacearum in Soil Using a Semiselective Medium and a PCR Technique［J］.Phytopathology,1998,146（8-9）:379-384

［9］Miller S A,Beed F D,Harmon C L.Plant Disease Diagnostic Capabilities and Networks［J］.Annual Review of Phytopathology,2009,47:15-38

［10］Thompson J D,Higgins D G,Gibson,T J. Clustal-w-improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice ［J］.Nucleic Acids Research,1994,22（22）:4673-4680

［11］Lou M M,Jin G L,Tian W X,et al.Specific and sensitive detection of Enterobacter mori using reliable RT-PCR reaction［J］.Plant disease:DOI:10.1094/PDIS-01-11-0011

［12］Morse R,Collins M D,O'Hanlon K,et al.Analysis of the β' subunit of DNA-dependent RNA polymerase does not support the hypothesis inferred from 16S rRNA analysis that Oenococcus oeni（formerly Leuconostoc oenos） is a tachytelic （fast-evolving） bacterium ［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,1996,46（4）:1004-1009

［13］Adékambi T,Drancourt M,Raoult D.The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists［J］.Trends in Microbiology,2009,17（1）:37-45

［14］St?ger A,Ruppitsch W.A rapid and sensitive method for the detection of Xanthomonas fragariae,causal agent of angular leafspot disease in strawberry plants［J］.Journal of microbiological methods,2004,58（2）:281-284

［15］Vandroemme J,Baeyen S,Van Vaerenbergh J,et al.Sensitive real-time PCR detection of Xanthomonas fragariae in strawberry plants［J］.Plant pathology,2008,57（3）:438-444

［16］Robène-Soustrade I,Laurent P,Gagnevin L,et al. Specific detection of Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae in anthurium （Anthurium andreanum） tissues by nested PCR ［J］. Applied and Environmental Microbiology,2006,72（2）:1072-1078