超声造影监测缺血再灌注损伤兔肾皮质血流动力学改变的实验研究

叶　帆，李明星，罗志建，陈晓梅，宣吉晴

（泸州医学院附属医院，四川 泸州　646000）

超声造影监测缺血再灌注损伤兔肾皮质血流动力学改变的实验研究

叶帆，李明星，罗志建，陈晓梅，宣吉晴

（泸州医学院附属医院，四川 泸州646000）

目的：采用超声造影（CEUS）定量分析技术动态监测肾缺血再灌注损伤（Renal ischemia reperfusion injury，RIRI）后兔肾皮质血流灌注的改变。方法：54只家兔随机分为正常对照组，肾缺血后再灌注第2 h组、第16 h组、第24 h组、第3 d组、第5 d组。行CEUS并应用时间-强度曲线测量灌注峰值时间（TTP）、曲线上升支斜率（β）、灌注峰值强度（A）、曲线下面积（AUC），观察各参数的变化并分析与病理改变的相关性。结果：肾缺血恢复灌注后各组与对照组相比TTP值增加，β值降低，AUC增大（P＜0.05）；缺血再灌注组各组间TTP、β有统计学差异，其中恢复灌注后第3d的TTP的延长和β的下降最为显著（P＜0.01）。A值在RIRI后第16 h，24 h，3 d较对照组降低（P＜0.05），第3d最为显著（P＜0.01）。结论：CEUS定量分析技术能在缺血再灌注损伤发生后早期发现肾皮质血流灌注的异常，肾缺血再灌注损伤早期即发生肾皮质微循环障碍，在第3 d肾皮质微循环灌注受损最为严重，度过这一“危险期”，肾皮质微循环受损得以改善，CEUS定量分析技术能敏感反映这一过程。

肾；再灌注损伤；兔；超声检查，多普勒，彩色；尿路造影术

肾脏作为机体主要的高血流灌注的器官之一，因缺乏侧支循环易发生肾缺血再灌注损伤（Renal ischemia reperfusion injury，RIRI）。RIRI是导致肾移植术后急性肾功能衰竭及影响移植肾早期功能恢复的关键因素之一。由于RIRI大多为可逆性损伤，及时诊断和治疗有助于肾功能的恢复。但由于RIRI没有特异的临床表现，且缺少合适的筛查方法，容易导致漏诊。肾血流动力学与肾功能损伤相互影响、相互作用，因此本研究通过制备家兔RIRI模型，应用超声造影（Contrast-enhanced ultrasonography，CEUS）定量分析RIRI后兔肾皮质微循环血流动力学的变化规律，探讨CEUS在临床早期诊断及预后判断中的价值。

1　材料与方法

1.1兔肾缺血再灌注模型的建立

1.1.1动物分组

健康成年新西兰大白兔54只，体质量2.1～2.5 kg（泸州医学院实验动物中心提供。动物许可证：SCXK川 201017）。54只家兔随机分为正常对照组（R0），缺血后再灌注第2 h组（R1）、第16 h组（R2）、第24 h组（R3），第3 d组（R4），第5 d组（R5），每组各9只。

1.1.2动物模型制作

目前RIRI动物模型的建立方法包括切除一侧肾脏，夹闭另一侧肾蒂或者夹闭双侧肾蒂，缺血时间不超过60 min。而切除一侧肾脏，夹闭另一侧肾动脉建立RIRI模型与双肾模型相比更接近肾移植状态［1］。因此本实验采取切除右肾，夹闭左肾动脉60 min后恢复灌流建立兔RIRI模型，与正常家兔比较RIRI前后肾皮质血流动力学改变。

R0组家兔行左肾CEUS，R1～R5组家兔给予速眠新Ⅱ（吉林省有限公司华牧动物保健品有限公司；规格：2 mL∶40 mg）0.2 mL/kg肌肉注射麻醉家兔。俯卧位固定，双肾区脱毛，消毒皮肤后行右侧腰背部正中旁切口，钝性分离肾周脂肪囊，暴露右肾，结扎右肾蒂，切除右肾，同样方法游离左肾后分离出左肾动脉，使用无创动脉夹夹闭肾动脉造成缺血，观察到左肾颜色由鲜红变暗红，表明缺血成功，60 min后松开动脉夹，观察左肾颜色由暗红变鲜红，表示再灌注成功，于松开动脉夹时开始计算再灌注时间。术后，室温下清洁饲养。R1、R2、R3、R4、R5组家兔分别于再灌注后第2 h、第16 h、第24 h、第3 d、第5 d行CEUS检查。各组家兔在完成CEUS检查后即刻处死并切除左肾，取部分左肾皮质经体积分数10%的甲醛固定，待测。组织经脱水、透明、浸蜡和包埋，常规切片（3 μm）作苏木精-伊红染色制片，光学显微镜放大倍数为40倍，交由病理专业人士进行检查，采用单盲法观察肾皮质病理变化情况。

1.2CEUS检查

采用GE LOGIQ 9彩超诊断仪，探头频率7.5MHz，谐波造影模式。进入造影模式后，保持仪器设置恒定（机械指数0.08，深度4 cm，增益52%，帧频50 Hz，动态范围50 dB，时间增益补偿，聚焦范围等滑块全部置于中间位置）。造影剂 SonoVue（BRACCO Imaging B.V公司生产，瑞士；规格：SF6气体59 mg∶冻干粉25 mg）按说明将冻干粉中注入生理盐水5 mL配置成混悬液，按0.1 mL/kg剂量抽取震荡混匀后的造影剂经耳缘静脉团注，随后注入1 mL生理盐水冲洗管道。注射造影剂的同时启动超声仪内置计时器，取肾冠状位最大截面观察并保存动态影像6 min。应用彩超仪内置时间-强度曲线（Time-intensity curve，TIC）分析软件（Wash in/Wash out）分析血流灌注参数。有研究表明对于不同大小及形状的感兴趣区（Region of interest，ROI），肾血流灌注各项定量参数之间存在着一定的差异［2］。此外肾皮质、髓质和皮质髓质交界处血流量也存在差异［3］。因此本实验中统一设置ROI为直径3 mm，面积为7.07 mm2的圆形，放置于肾最大冠状截面中央的肾实质中部以保证所得的各灌注参数具有可比性。

观察和分析如下指标：①视觉状态下造影增强及消退模式；②TIC曲线参数：灌注峰值时间（Time to pick，TTP）；曲线上升支斜率（β）；灌注峰值强度（Amplitude of peak intence，A）；曲线下面积（Area under curve，AUC）。所有参数连续测量3次以减少误差。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件处理所得数据，以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1兔肾灰阶CEUS表现

R1～R5组45只家兔成功制作成RIRI模型。灰阶CEUS模式下，R0在经耳缘静脉团注造影剂后，沿肾各级动脉依次增强，至整个左肾肾皮质、肾髓质形成“火球样”增强。R1～R5组造影增强模式同前，但肾皮质增强达高峰时间延迟，消退时间延长。

2.2各组TIC参数比较

各组经Wash in/Wash out软件自动描记生成的TIC曲线见图1～6。

图1　正常对照组（R0组）兔肾皮质TIC曲线。　图2　RIRI后第2 h（R1组）兔肾皮质TIC曲线。Figure 1.The TIC of the control group（R0）.　Figure 2.The TIC of reperfusion group for 2 h（R1）.

在发生RIRI前后的不同阶段，各灌注参数的改变见表1，与对照组相比，RIRI发生后的不同阶段均表现为TTP延长，β降低（P＜0.05），RIRI各组间TTP及β的差异具有统计学意义。其中RIRI发生后2 h后即可观察到TTP延长，β降低，随RIRI进展TTP延长及β降低的程度加重，第3 d最为显著（P＜0.01），而恢复灌注后第5 d的TTP和β则有所改善。A值在RIRI后第16 h，24 h，3 d较对照组降低（P＜0.05），第3 d最为显著（P＜0.01）。AUC在RIRI后各组与对照组相比均增加（P＜0.05），但RIRI各组组间AUC并无显著差异（P＞0.05）。

图3　RIRI后第16 h（R2组）兔肾皮质TIC曲线。　图4　RIRI后第24 h（R3组）兔肾皮质TIC曲线。Figure 3.　The TIC of reperfusion group for 16 h（R2）.Figure 4.　The TIC of reperfusion group for 24 h（R3）.

图5　RIRI后第3 d（R4组）兔肾皮质TIC曲线。　图6　RIRI后第5 d（R5组）兔肾皮质TIC曲线。Figure 5.The TIC of reperfusion group for 3 d（R4）.Figure 6.The TIC of reperfusion group for 5 d（R5）.

Table 1　Analysis of TIC parameters in different groups

发生RIRI 2 h后，肾小球结构无明显变化，肾小管上皮细胞轻微变性，肾间质水肿不明显，仅少许炎细胞浸润，随时间延长，肾小管上皮细胞肿胀、坏死和脱落，管腔扩张，肾间质水肿、炎性细胞浸润的程度随之加重，肾小管管腔内见大量管型，直小静脉内可见大量红细胞聚集，间质可见炎细胞浸润。R5组肾小管上皮细胞变性及坏死及间质充血、水肿有所改善，新生毛细血管数量增多，部分肾小管上皮细胞出现再生现象。

3　讨论

RIRI后存在肾内血流动力学和血流分布的异常，整体肾血流量可降低约50%。超声可通过彩色多普勒测量肾各级动脉的血流参数等指标来推断肾血流灌注的改变。虽然彩色多普勒半定量评价肾脏血流灌注有肯定的价值，但受操作者手法、仪器分辨率及不能对肾弓形动脉及其以下微小血管的血流灌注进行显像检测的局限而限制了其在监测微小血管血流方面的运用。SonoVue是新一代超声造影剂，其采用磷脂包裹的微气泡大小与红细胞相仿，溶解在血液中能自由通过毛细血管，平均消除半衰期为12min，能在外周血液循环中持续较长时间，经呼吸排泄无肾毒性。在低机械指数下，微泡能产生很好的非线性振动而不被破坏，从而使实质器官血流得到有效的长时间连续增强显像，特别是能较好地显示细小和低速血流，结合TIC曲线可以定量分析血流灌注特征［4］。

实验证明肾缺血再灌注24 h内肾动脉可出现明显的血流动力学变化［5］。本研究中，RIRI后2 h即观察到TTP延长，β减低。TTP代表肾皮质造影剂开始增强到达峰值的时间，β代表造影剂开始增强后的灌注速率［6］，在CEUS定量灌注参数中，RIRI各组间TTP和β出现显著性差异，表明其是能动态反映肾皮质灌注的敏感指标。随着缺血再灌注损伤的发展，肾脏自身调节失衡，肾组织内肾素-血管紧张素系统激活，肾皮质合成前列环素减少和血栓素增加，血管内皮细胞受损致一氧化氮释放减少及内皮素释放增加，共同导致肾小血管痉挛收缩；血管内皮细胞受损，表达多种炎症介质和促炎因子，如肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、血栓素A2（TXA2）等，促进血小板和中性粒细胞沿血管内皮滚动、黏附、聚集和外渗，导致肾微血管损伤，血管通透性增加造成组织水肿挤压微血管，中性粒细胞与内皮细胞粘附，聚集，嵌顿，血小板及纤维蛋白形成微血栓栓塞毛细血管，共同造成无复流现象，导致微循环阻力增高，造影剂进入肾毛细血管床的时间延长，表现为TTP延长，β降低。另外本实验观察到发生RIRI后TTP的延长和β的降低的程度随时间延长而加重，在RIRI后第3 d达到高峰，在RIRI后第5 d则有所改善［7］。二者的动态变化与肾皮质病理表现相关，表现在发生RIRI后，随时间延长肾小管上皮细胞变性坏死和脱落，管腔扩张，肾间质水肿、炎细胞浸润随之加重，RIRI后第3 d最为显著，而第5 d肾小管上皮细胞变性及坏死及间质充血、水肿有所改善，表明RIRI后前3 d是一危险期，度过这一危险期后，随着肾小管上皮细胞再生修复，微循环改善，反映在TIC曲线参数上TTP缩短，β值增高。

A值反映瞬时的感兴趣区血流容积。于本实验中观察到A值在RIRI后第16 h后开始下降，第3 d下降最为显著（R4组与R2组、R3组比较，P＜0.05）。结合病理考虑可能为血管内皮细胞肿胀，肾小动脉及肾小球毛细血管网内有广泛的纤维蛋白和血小板沉着，致使血管腔变窄，血流阻力增加，肾血流量明显降低。而RIRI早期及后期A值与对照组相比无明显变化，除考虑到早期肾微循环损伤较轻微及后期微循环改善导致肾血流量减少程度较低外，也与A值所表达的增强值是瞬间的，累积效应不明显相关。本实验观察到发生RIRI后AUC值较对照组增高，RIRI组间AUC并无显著差异。这与RIRI引起的肾血流量减少的病理生理表现不符。RIRI后AUC增加与肾血流量减少相背离涉及肾脏血流动力学、血管内皮细胞损伤和炎症反应的相互作用等诸多因素。分析原因为RIRI引起肾血流量减少，同时RIRI后皮质灌注速度降低，微泡廓清速度减慢，导致造影剂在肾毛细血管网内密度增加，此外RIRI后血管内皮细胞通透性增加，大量的炎细胞趋化、淤滞于微血管及间质内，对微泡有吞噬作用，被吞噬的微泡依然保持声学活性而仍能被检测到。综上所述AUC反映的是一定时间内造影增强的累积效应，微泡廓清速度减慢、炎细胞对造影剂的吞噬作用导致局部感兴趣区一定时间内微泡密度的增加，使AUC增高，不能真实反映肾皮质的血流量。本实验认为A值和AUC对判断肾组织的血流动力学的改变有一定的研究价值，但目前不能作为组织的血容量的定量指标来进行评估。

综上所述，RIRI发生后前三天内随时间延长镜下肾小管上皮细胞变性坏死，肾间质水肿，炎细胞浸润程度加重。肾微血管强烈收缩、内皮细胞损伤、白细胞淤滞，微血栓形成。RIRI后第三天肾皮质损伤最为严重，而渡过这一“危险期”，部分肾小管上皮细胞出现再生现象，新生毛细血管数量增多，肾皮质微循环受损得以改善。CEUS定量分析技术能在早期即发现兔RIRI所致的肾血流灌注异常，并能动态反映RIRI后肾皮质血流灌注的变化及转归。肾血流动力学与肾功能损伤是相互影响、相互作用的，若CEUS探测到RIRI后3 d内肾皮质出现明显的血流动力学变化时应考虑到肾损伤的存在，特别是TTP及β对指导临床早期诊治RIRI及评价疗效有较大价值。

［1］余晓东，廖波，邓显忠，等.一种新型实用的大鼠肾缺血再灌注损伤模型的建立［J］.重庆医学，2011，40（13）：1283-1284.

［2］董怡，王文平，黄咏红，等.健康实验兔肾血流灌注超声造影定量分析方法学研究 ［J］.中华医学超声杂志：电子版，2010，7（7）：1127-1133.

［3］Andonian S，Coulthard T，Smith AD，et al.Real-time quantitation of renal ischemia using targeted microbubbles：in-vivo measurement of P-selectin expression［J］.J Endourol，2009，23（3）：373-378.

［4］Kinns J，Aronson L，Hauptman J，et al.Contrast-enhanced ultrasound of the feline kidney［J］.Vet Radiol Ultrasound，2010，51（2）：168-172.

［5］陈晓梅，李明星，李昆萍，等.缺血再灌注的兔肾动脉阻力指数与肾组织TNF-α表达的相关性研究 ［J］.重庆医学，2011，40（34）：3474-3476.

［6］Leinonen MR，Raekallio MR，Vainio OM，et al.Quantitative contrast-enhanced ultrasonographic analysis of perfusion in the kidneys，liver，pancreas，small intestine，and mesenteric lymph nodes in healthy cats［J］.Am J Vet Res，2010，71（11）：1305-1311.

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Study on contrast-enhanced ultrasonography in quantitative evaluation of rabbit's cortex hemodynamics after renal ischemia reperfusion injury

YE Fan，LI Ming-xing，LUO Zhi-jian，CHEN Xiao-mei，XUAN Ji-qing
（The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou Sichuan 646000，China）

Objective：To explore the value of contrast-enhanced ultrasonography（CEUS）in quantitative evaluation of rabbit's cortex hemodynamic changes after renal ischemia reperfusion injury（RIRI）.Methods：All the 54 rabbits were randomly divided into control group and different time groups at 2 h，16 h，24 h，3 d，5 d after ischemia reperfusion.Using CEUS to observe the pattern of rabbits'renal perfusion and perfusion peak time（TTP），curve rising slope rate（β），amplitude of peak intensity（A），and area under the curve（AUC）.And researched the relativity between quantitative evaluation of rabbit's cortex hemodynamics by CEUS and renal pathologic changes.Result：Compared with control group，the TTP and AUC extend，β decreased after RIRI（P＜0.05）.TTP and β had difference in RIRI groups，while the most significant changes happened at 3 d after reperfusion（P＜0.01）.Compared with control group，the A decreased at 16 h，24 h，3 d after RIRI（P＜0.05），while the most significant changes happened at 3 d after reperfusion（P＜0.01）.Conclusion：CEUS combined with quantitative analysis can catch early the rabbit's cortex hemodynamic changes after RIRI.Renal cortex microcirculation suffered the most severe damage at 3 d after RIRI.It would get better while passed through the crisis.CEUS can reflect these changes sensitively.

Kidney；Reperfusion injury；Rabbits；Ultrasonography，Doppler，color；Urography

R334.1；R814.43

A

1008-1062（2015）06-0413-04

2014-11-03；

2014-11-17

叶帆（1986-），女，四川泸州人，医师。

四川省教育厅科研资助课题（项目编号：142A0139）。