硼酸亲和杂化毛细管整体柱选择性富集蒲公英中的活性物质

2015-10-16杨琴，周平

分析科学学报 2015年2期

杨琴，周平

(1.湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430064； 2.武汉大学化学与分子科学学院,湖北武汉 430072)

硼酸亲和色谱是一种以硼酸为配位体，选择性富集顺式二羟基化合物的液相色谱，广泛应用于核苷和糖类等生物分子的富集[1，2]。毛细管整体柱作为第四代色谱分离介质，在分离分析领域得到了广泛应用，特别是有机-无机杂化整体柱，具有机械强度高、pH范围宽、不易收缩、无需后修饰等优点[3]。因此，将以上二者结合制备硼酸亲和毛细管整体柱的研究引起了学者广泛兴趣[4 - 6]。

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)味苦、甘，性寒，具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋之功效[7]。其所含咖啡酸、绿原酸等酚酸类活性物质具有顺式二羟基结构，可用硼酸亲和色谱纯化富集。硼酸亲和色谱机理为：水溶液中，硼酸中的硼原子有一个空轨道，碱性环境下该空轨道易受到溶液中OH-的孤对电子作用，形成配位键，硼酸基团由原来的平面三角形结构变成四面体结构的硼酸阴离子，可以与共平面的1,2或1,3-顺式二羟基分子发生亲和作用，生成五元或六元环酯；当反应环境由碱性变为酸性时,OH-质子化，配位键断开，硼酸构型发生变化，环酯发生水解，反应逆向进行，整个反应是一个快速、可逆的过程，受环境pH控制[8]。传统硼酸亲和色谱在碱性条件下才具有较强的亲和能力，这限制了硼酸亲和色谱的应用，因此发展中性条件下具有高亲和力的硼酸亲和整体柱成为研究热点[9，10]。我们曾制备了新型硼酸亲和杂化毛细管整体柱[11]。在此基础上，本工作研究了该整体柱在中性条件下对蒲公英中咖啡酸、绿原酸的选择性富集效果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20AD毛细管高效液相泵(日本，岛津公司)；UV-2500紫外检测器(德国，诺尔公司)；EC2000数据工作站(大连依利特公司)；7725i微量进样阀(美国Rheodyne公司)；Agilent 1100 Series LC 系统(美国，安捷伦公司)；石英毛细管(50 cm×250 μm i.d.,365 μm o.d.,河北永年锐沣公司)；pH计(瑞士，Mettler Toledo公司)。

四乙氧基硅烷(TEOS)、3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)和N-氨乙基-3-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPTES)，均购自武大有机硅新材料有限公司；偶氮二异丁腈(AIBN)、4-乙烯基苯硼酸(VPBA)，均购自上海阿拉丁试剂有限公司；绿原酸(批号:110752-200212)、咖啡酸(批号:20050220)，均购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

蒲公英全草由湖北中医药大学药学院生药教研室提供。

1.2 毛细管整体柱的制备

硼酸亲和杂化毛细管整体柱按文献方法[11]制备。250 μm内径的熔融石英毛细管依次用0.1 mol·L-1NaOH溶液冲洗1 h、0.1 mol·L-1HCl冲洗1 h、超纯水冲洗0.5 h、乙醇冲洗0.5 h、用氮气吹干后置于烘箱40 ℃备用。将TEOS、γ-MAPS、CTAB、AIBN、VPBA、水、乙醇按不同比例混合于1.5 mL EP管，冰水浴超声5 min，加入适量AEAPTES，涡旋使其混合均匀，冰水浴超声30 s。将所得溶胶用氮气压入预处理好的毛细管内，用硅橡胶封住毛细管两端，置于60 ℃烘箱反应12 h后，将毛细管连接到微高效液相泵上，用甲醇和超纯水以1 μL·min-1流速冲洗整体柱，除去未反应的试剂，即制得所需整体柱。

1.3 对照品溶液的制备

称取咖啡酸、绿原酸对照品适量，用甲醇溶解，配制成0.5 mg·mL-1的对照品储备液，经0.22 μm滤膜过滤，在4 ℃条件下避光保存。实验前用流动相稀释至所需浓度。

1.4 蒲公英样品的处理

称取适量经粉碎后的蒲公英全草粉末，加10倍质量的甲醇超声提取、过滤；滤渣再加8倍质量的甲醇超声提取、过滤；合并两次滤液，旋转蒸发至干，加水定容至一定体积。取适量甲醇提液用水(醇提液与水体积比为1∶4)分散后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取、回收，冷冻干燥后用甲醇定容成 1 mg·mL-1,经0.22 μm滤膜过滤，在4 ℃条件下避光保存。实验前用流动相稀释至所需浓度[12]。

2 结果与讨论

图1 微柱高效液相色谱系统Fig.1 Schematic representation of the μ -HPLC setup

2.1 微柱高效液相色谱分析条件

微柱高效液相色谱系统由微高效液相泵、紫外检测器、色谱工作站、手动微量进样阀、自制200 nL毛细管定量环和毛细管整体柱(25 cm)组成，如图1所示。取一段250 μm i.d.毛细管，烧去外层聚酰亚胺涂层(2 mm)作为检测窗口，整体柱与检测毛细管以PTFE软管相连。上样流动相为0.2 mol·L-1碳酸铵-0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH=7.0)，洗脱流动相为0.1 mol·L-1乙酸(pH=2.7)，流速为10 μL·min-1(有特殊说明除外)，检测波长275 nm。

图2 不同pH条件下对苯二酚和邻苯二酚的色谱图Fig.2 Chromatograms of quinol and catechol on the monolithic column at different pH1:quinol;2:catechol

2.2 高效液相色谱分析条件

经实验，优化后的HPLC条件如下[12]：色谱柱：Agilent HC-C18 柱(250×4.6 mm)。流动相：A 相为乙腈-水=10∶90(V/V；含0.1%TFA)，B相为乙腈-水=90∶10(V/V；含0.1%TFA)；线性梯度洗脱程序：0～30 min，100%A～100%B。流速l mL·min-1；检测波长为 214 nm。

2.3 中性条件下邻苯二酚的分离与富集

按2.1节条件，当以pH为6.5、7.0、7.5的0.2 mol·L-1碳酸铵-0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液作为流动相时，对苯二酚在整体柱上不保留，邻苯二酚则被吸附在固定相上，且当pH≥7.0时，吸附牢靠(图2)。在12 min时，将流动相换成0.1 mol·L-1的乙酸，邻苯二酚被洗脱出来。结果表明，所制备的硼酸亲和杂化毛细管整体柱在中性条件下对顺式二羟基化合物有选择性吸附作用。

图3 蒲公英提取液直接进样(a)以及蒲公英提取液经整体柱富集后(b) 的色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of (a) an extract sample of Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.and(b) an extract sample of Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.after enrichment by the monolithic column1:chlorogenic acid;2:cafeic acid

2.4 蒲公英提取物中绿原酸和咖啡酸的分离

直接将蒲公英提取物样品进样，按2.2节条件分离，结果如图3a所示：绿原酸和咖啡酸只出现了极小的色谱峰，表明二者含量很低。另取适量蒲公英提取物样品进行富集实验，当上样流动相为0.2 mol·L-1碳酸铵-0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液时，绿原酸和咖啡酸被保留并且富集在整体柱上，其它物质被直接洗脱；将流动相切换成0.1 mol·L-1的乙酸后，吸附在整体柱上的绿原酸和咖啡酸被洗脱，收集洗脱液，按优化条件进行HPLC检测，得到的色谱图如图3b所示：蒲公英提取物中绿原酸和咖啡酸的色谱峰的峰高和峰面积显著增大，表明该整体柱能很好地富集蒲公英中的绿原酸和咖啡酸。