高效液相色谱-串联质谱法同时测定茶汤中7种苯甲酰脲类农药残留

2015-10-16薛芝敏付凤富

分析科学学报 2015年2期

薛芝敏，付凤富

(1.福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，福建福州 350001； 2.福州大学食品安全分析与检测教育部重点实验室，福建福州 3501116)

苯甲酰脲类农药具有低剂量、低环境持久性、易生物降解和对哺乳动物低毒等特点，越来越多地被用于作物病虫害的控制[1，2]。苯甲酰脲类农药虽然对哺乳动物的毒性相对较低，但植物中的苯甲酰脲类农药残留仍可通过食物链对人体健康造成伤害。美国环境保护署(EPA)已将一些苯甲酰脲类农药归类为毒性Ⅲ级或Ⅳ级的中等毒性物质[3]。目前，许多国家都已规定了针对茶叶的有关苯甲酰脲类农药的最大残留限量值(MRL)。我国有关茶叶中苯甲酰脲类农药残留的研究报道还较少，但国家标准(GB 2763-2012)规定茶叶中除虫脲的最大残留限量为20 mg/kg。目前，检测机构主要通过检测成品茶叶中的农药残留。但茶叶是一种饮料，许多研究表明，茶汤中农药残留不仅取决于成品茶中的农药残留，也取决于农药的溶出特性[4，5]。因此，研究同时检测茶汤中多种苯甲酰脲类农药的高灵敏和快速分析方法具有十分重要的意义。

迄今为止，有关苯甲酰脲类农药的分析检测方法主要有高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用技术，并已被广泛应用于食品中苯甲酰脲类农药的测定[6 - 12]。然而，有关茶汤中多种苯甲酰脲类农药的同时检测的研究报道还比较少见[4，5]。本研究中，我们开发了一种基于高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)，结合溶剂提取和固相萃取，同时分析检测茶汤中氟啶脲、除虫脲、啶蜱脲、伏虫隆、氟铃脲、氟虫脲和杀铃脲7种苯甲酰脲类农药的分析方法，以期为更加准确地评价茶叶的消费安全提供方法支持。

1 实验部分

1.1 仪器及工作条件

安捷伦1290/6410 HPLC-MS/MS仪(美国，安捷公司)，配置安捷伦Zorbax SB-C18高效色谱柱。流动相为2 mmol/L乙酸铵溶液和甲醇，按下面程序进行梯度洗脱：70%(V/V)的甲醇在7 min内线性增加到100%的甲醇，然后在0.5 min内线性降至70%的甲醇并保持3 min。流动相的流速为0.3 mL/min，柱温为35 ℃。质谱仪配备电喷雾离子源(ESI)，采用负离子扫描模式，多反应监测(MRM)。离子源电压为±4 kV，离子源温度为300 ℃，雾化压力为50 psi，干燥气体(N2)流量为8.0 L/min，干燥气的温度为350 ℃，采用完整MS2扫描方式在m/z100～550范围内进行扫描。用于每种苯甲酰脲类农药检测的离子以及其分子式和分子量如表1所示。

表1 7种苯甲酰脲类农药的分子式、母体离子和用于HPLC-MS/MS测定的选择性离子

1.2 试剂

7种苯甲酰脲类农药氟啶脲(CHLO)，除虫脲(DIFL)，啶蜱脲(FLUA)，氟虫脲(FLUF)，氟铃脲(HEXA)，伏虫隆(TEFL)和杀铃脲(TRIF)标准品均为德国Dr.Ehrenstorfer公司生产，购自北京振翔工贸有限责任公司。用甲醇稀释、溶解以上标准物质，制备100 μg/mL标准储备溶液，在-5 ℃保存并在3个月内使用。乙酸铵(色谱级)为美国ROE公司生产，甲醇(色谱级)为美国天地公司生产。弗罗里硅土(60～100目)购自美国SUPELCO公司，活性炭(36～50目)购自中国国药公司。实验中所用的水为Mili-Q水(18.2 MΩ·cm)。

1.3 实验方法

实验中所测定的茶叶由福建茶检中心提供，已确认含有苯甲酰脲类农药残留。茶叶的冲泡方法与日常消费者的习惯泡茶方法相同。取约5 g的茶叶样品，加入开水110 mL浸泡2 min后，分离出茶汤溶液(第1次茶汤)。残留茶叶再重复用110 mL沸水冲泡2次，每次冲泡的时间分别为3 min和5 min，得到第2次茶汤和第3次茶汤。茶汤冷却后，用于7种苯甲酰脲类农药的检测。

首先，移取50 mL的茶汤到分液漏斗，加入15 mL二氯甲烷，充分振荡萃取5 min，静置后分离出有机相溶液。残留的茶汤溶液用相同的方法再重复萃取1次，2次萃取的有机相溶液合并获得总萃取溶液。总萃取溶液在45 ℃水浴条件下，用氮吹仪浓缩至约1 mL。然后，把浓缩后的二氯甲烷萃取液移入固相萃取小柱(6×1 cm i.d.填有0.50 g弗罗里硅土和0.05 g活性炭，预先用10 mL 25%的乙腈和75%甲苯混合溶液淋洗)。接着，用20 mL的乙腈和甲苯混合溶剂(1∶3,V/V)洗脱吸附在固相萃取小柱上的苯甲酰脲类农药，并在45 ℃水浴条件下用氮吹仪将洗脱液吹至近干，残留物重新用1 mL甲醇再次溶解，最终的甲醇溶液用于HPLC-MS/MS分析。同时，在另一组茶汤样品中加入终浓度为1 ng/mL的7种苯甲酰脲类农药标准物质，然后按上述同样的方法进行萃取、预富集和测定以获得回收率。

2 结果与讨论

2.1 茶汤中7种苯甲酰脲类农药残留的提取和前处理优化

2.1.1提取溶剂的选择考虑到本文研究的7种苯甲酰脲类农药的溶解性质和提取溶剂的溶解度，二氯甲烷和乙酸乙酯被尝试用于提取茶汤中的7种苯甲酰脲类农药。实验结果表明，二氯甲烷能有效提取全部7种苯甲酰脲类农药。因此，本文采用二氯甲烷作为提取溶剂。

提取溶剂与茶汤样品的体积比是提取茶汤中所有苯甲酰脲类农药的另一个重要因素。实验结果表明，提取溶剂体积与茶汤样品体积的最佳比例为3∶10。比例太高将提高试剂空白的背景，损失了方法检测限；而比例偏低，则提取效率较低，最终也导致方法灵敏度的降低。

2.1.2提取时间对提取效率的影响实验分别选择提取时间1、2、5、7、10 min，考察提取时间对提取效率的影响。结果表明，提取时间在1～5 min内，提取效率随提取时间的增加而增加，但在5～10 min内，随着提取时间的增加提取效率基本上不再变化、达到最大值，所以选择5 min为最佳提取时间。

在上述最佳提取溶剂/茶汤样品体积比和提取时间下，经过2次提取，茶汤中所有苯甲酰脲类农药的提取率可达90%以上。

2.1.3提取液预处理条件优化文献报道活性炭可以有效去除茶叶提取液中的色素，而弗罗里硅土可以有效去除茶叶提取液中其他杂质比如糖类、酯类等[13]。所以，在本实验中我们利用一根长6 cm、内径1 cm的弗罗里硅土和活性炭固相萃取小柱对茶汤提取液中的苯甲酰脲类农药进行预富集，并去除色素和糖类、酯类等干扰物质。实验结果表明，在长6 cm、内径1 cm的小柱中填充0.5 g弗罗里硅土和0.05 g活性炭，可以去除茶汤提取液中大部分的色素、糖类和酯类等干扰物质，并获得满意回收率。

图1 7种苯甲酰脲类农药的色谱图Fig.1 The chromatograms of 7 benzoylurea pesticides(A)Mixed standards solution of 7 benzoylurea pesticides(10 ng/mL CHLO,100 ng/mL DIFL,20 ng/mL FLUA,100 ng/mL FLUF,5 ng/mL HEXA,20 ng/mL TEFL and 20 ng/mL TRIF);(B)Oolong tea infusion;(C)Green tea infusion;(D)blank.

根据7种苯甲酰脲类农药的极性，乙腈和甲苯的混合物被用于洗脱吸附在活性炭/弗罗里硅土固相小柱上的苯甲酰脲类农药。通过使用不同体积比的乙腈和甲苯混合液(1∶1，1∶2，1∶3，1∶4)为溶剂对乙腈和甲苯的比例进行优化，结果表明乙腈/甲苯(V/V)=1/3是最好的选择。利用20 mL乙腈和甲苯混合溶剂可以把吸附在活性炭/弗罗里硅土固相小柱上的苯甲酰脲类农药完全洗脱下来。

2.2 方法线性范围、重现性和检测限

样品经上述提取和预处理后，利用HPLC-MS/MS对乌龙茶和绿茶茶汤样品中的7种苯甲酰脲类农药的浓度进行了测定，其色谱图如图1所示。可以清楚地观察到7种苯甲酰脲类农药在6.5 min内被完全分离，基本没有基质干扰。绘制了校准曲线。结果表明氟啶脲在0.25～10 ng/mL的浓度范围内，除虫脲和氟虫脲在5.0～250 ng/mL的浓度范围内，啶脾脲、氟苯脲和杀铃脲在0.5～20 ng/mL的浓度范围内，氟铃脲在0.13～5.0 ng/mL的浓度范围内，其色谱峰锋面积和浓度呈良好的线性关系。其线性方程、检测限和相对标准偏差(RSD)见表2。从表2可知，7种苯甲酰脲类农药的检测限(DL)和定量限(QL)分别为0.08～1.00 ng/mL和0.09～3.02 ng/mL。6次重复测定的RSD小于8%(n=6)。