基于精确质量数筛选的超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱法快速鉴别化妆品中的邻苯二甲酸酯

2015-10-16李兆永王凤美牛增元陈军辉王小如

分析科学学报 2015年2期

李兆永, 王凤美, 牛增元* , 罗忻, 陈军辉, 王小如

(1.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东青岛 266002；2.国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心，山东青岛 266061)

邻苯二甲酸酯(Phthalic Acid Esters,PAEs)是一类应用广泛的塑料添加剂，常作为溶剂和定香剂被添加到化妆品中，以增加产品的柔韧性并保持其香味持久不易挥发[1]。PAEs是国际上重点监控的内分泌干扰物，这类物质损害人类的生殖系统，影响生物体内激素的正常分泌，导致细胞突变，致畸和致癌[2]。欧盟化妆品新法规[3]和我国《化妆品卫生规范》[4]均明文规定多种PAEs化合物为禁用物质。因此，建立快速、准确检测化妆品中PAEs的方法，对人类健康和化妆品行业秩序的规范都有重要的意义。

目前有关PAEs的测定方法主要有气相色谱法[5]、液相色谱法[6 - 8]、气相色谱-质谱联用法[9 - 12]和液相色谱-质谱联用法[13 - 16]等。近年来，液质联用技术因其特异性好，灵敏度高等特点而发展为PAEs分析的主要方法。黄琦君等[13]采用高效液相色谱-串联质谱法，实现了水溶性化妆品中10种PAEs的同时测定；Xu等[15]应用液相色谱-质谱联用技术建立了食品中多种PAEs的测定方法。但这些方法均是使用低分辨质谱技术进行的PAEs分析检测，有可能将含量比较高的杂质误认为是待测化合物从而产生定量和定性方面的偏差，并且对没有标准品的未知化合物的筛选鉴别有一定的局限性。由于化妆品种类繁多且基质复杂，需要采用具有更高灵敏度的和更强抗基质干扰的先进方法。线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(LTQ/Orbitrap MS)兼有离子阱和高分辨质谱平行检测的能力，离子阱的多级质谱功能可获得碎片信息，高分辨质谱可获得精确质量数，可以弥补低分辨质谱技术的不足，适用于复杂基质中化合物的快速筛选和鉴别分析[17]。目前，LTQ/Orbitrap技术已先后应用于生物[18]、食品[19]和纺织品[20]等领域。本课题组在前期研究中采用HPLC-LTQ/Orbitrap MS实现了纺织品中致癌染料的筛查和确证[21]，而LTQ/Orbitrap技术用于快速鉴定化妆品中PAEs的研究尚未见报道。本研究采用超高效液相色谱(UPLC)-LTQ/Orbitrap MS技术，建立基于化合物精确质量数筛选的化妆品中PAEs的快速鉴别方法，为保障化妆品安全，规范化妆品行业秩序提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪(美国，Waters公司)；Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL 组合式高分辨质谱仪(美国，ThermoFisher公司)；Himac CR22GII高速冷冻离心机(日本，日立公司)；MS1Minishaker旋涡混合器(德国，IKA公司)；KQ-400KDE 型高功率数控超声波仪(江苏昆山超声仪器有限公司)；FA1104型电子天平(上海精天电子仪器厂)。

邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、邻苯二甲酸二苯酯(DPhP)、邻苯二甲酸二丙酯(DPrP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸二己酯(DHXP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸二正戊酯(DPP)及邻苯二甲酸二正辛酯(DNOP)均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司(纯度均≥99%)。分别准确称取PAEs标准品，用甲醇分别配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液，于-18 ℃保存。临用时根据需要逐级稀释成不同质量浓度的系列混合标准工作溶液。甲醇，乙腈(美国Burdick & Jackson公司)和甲酸(美国Fluka公司)均为色谱纯。超纯水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q超纯水系统(美国Millipore)制得。

1.2 样品的处理

为避免干扰，实验均采用玻璃容器。化妆品样品按不同类型分别进行前处理。

1.2.1水剂样品准确称取1.0 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋3 min，超声提取15 min，过0.22 μm滤膜，待分析。

1.2.2膏体、乳剂样品准确称取1.0 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋3 min，超声提取15 min，4 000 r/min离心5 min，过0.22 μm滤膜，待分析。

1.2.3油剂样品准确称取1.0 g样品于50 mL离心管中，加入10 mL甲醇，涡旋3 min，超声提取15 min后加入10 mL正己烷，涡旋混匀，静置分层，弃去正己烷层，过0.22 μm滤膜，待分析。

1.3 色谱-质谱条件

1.3.1色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100×2.1 mm,1.7 μm)；流速:0.25 mL/min；进样量:10 μL；柱温:30 ℃；流动相A为水(含5 mmol/L乙酸铵和0.1%(V/V)甲酸)，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～5 min，20%～30%B；5～7.5 min，30%～55%B；7.5～15 min，55%～95%B；15～20 min，95%B；20～20.1 min，95%～20%B。

1.3.2质谱条件可加热的电喷雾离子源(HESI)；质量分析器:FT Orbitrap；离子化方式:ESI+；毛细管温度:350 ℃；喷雾电压:3.0 kV；管状透镜电压:80 V；鞘气(N2)压力:2.067×105Pa；辅助气(N2)流量:200 L/h；质量范围(m/z):100～1 000。采用平行模式扫描：静电场轨道阱高分辨扫描(分辨率R=30 000)，再对其中响应较强的二级碎片离子进行线性离子阱扫描；归一化能量:35%。14种PAEs化合物的UPLC-LTQ/Orbitrap MS分析参数见表1。

表1 14种PAEs化合物的分析参数

(续表1)

No.CompoundFormulaRetention time(min)Ion formation[M+H]+Measured (m/z)Mass accuracy error(10-6)Fragment ion2DMEPC14H18O67.45[M+H]+283.11761283.11668-3.28207.064143DEEPC16H22O68.97[M+H]+311.14891311.14804-2.80221.079894DEHPC24H38O417.41[M+H]+391.28429391.28354-1.92149.022835DNOPC24H38O417.92[M+H]+391.28429391.28404-0.64149.022786BMPPC20H30O414.97[M+H]+335.22169335.22088-2.42251.126907DHXPC20H30O415.32[M+H]+335.22169335.22068-3.01149.022818DPhPC20H14O411.40[M+H]+319.09649319.096500.03225.054349DBPC16H22O412.25[M+H]+279.15909279.159330.86149.02300,205.0858210DIBPC16H22O417.41[M+H]+279.15909279.159180.32149.02307,205.0857811DPrPC14H18O414.97[M+H]+251.12779251.12714-2.59191.06981,149.0228812DCHPC20H26O414.18[M+H]+331.19039331.190791.21149.02301,249.1121613DEPC12H14O49.02[M+H]+223.09649223.09646-0.13177.0544814DPPC18H26O414.02[M+H]+307.19039307.18955-2.73149.02263,219.10075

2 结果与讨论

2.1 样品提取

对化妆品中PAEs化合物的提取国内外研究较多。因PAEs难溶于水，较易溶于有机溶剂，多数文献中均采用有机溶剂提取。本实验在文献的基础上，采用加标回收的方法分别用不同的溶剂(甲醇、乙腈、甲醇水50%(V/V)、乙腈水50%(V/V)、乙酸乙酯、丙酮)，在不同的超声时间(5、10、15、20、25 min)，针对不同剂型的化妆品样品进行了提取，以考察提取效果。通过对比回收率结果发现：以甲醇为提取溶剂，超声提取15 min时的提取效果最好。

2.2 色谱/质谱条件的优化

图1 14种PAEs混合标准品提取总离子流色谱图Fig.1 Extracted total ion current chromatograms of 14 PAEs standards

PAEs常温下呈无色粘稠状液体，难溶于水而易溶于有机溶剂，适合在反相色谱柱上分离。采用反相色谱柱分离PAEs的研究已有报道[8,15]。本研究使用14种常见PAEs混合标准溶液进行分离条件的优化。首先，以水(含5 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸)-乙腈为流动相，比较了C8和C18两种色谱柱对14种PAEs成分的分离效果，结果发现C18柱对14种标准品的分离效果较好。对比不同生产厂家的C18色谱柱，发现不同厂家的C18柱对PAEs的分离选择性差异不大，本研究所用的ACQUITY UPLC BEH C18柱采用1.7 μm颗粒度的柱填料能大幅提升色谱柱的性能，从而获得更高的柱效；其次，对流动相的组成，流动相中乙酸铵和甲酸的浓度、流速等条件进行了系统优化，在最佳分离条件下，所有PAEs化合物包括同分异构体之间均能达到基线分离，14种PAEs混合标准溶液分离结果见图1(进样量10 μL)，完全能满足UPLC-LTQ/Orbitrap MS快速筛查化妆品中多种PAEs化合物的检测要求，并且峰形良好，基质干扰影响小。

据文献报道，PAEs类化合物在ESI+下发生电离通常产生[M+H]+峰。本研究对14种PAEs化合物的质谱条件进行了优化，以获得最佳的灵敏度。首先分别采用正负模式全扫描对14种PAEs标准化合物进行了分析，结果发现14种化合物只在ESI+条件下有响应，且产生[M+H]+峰。因此，本研究采用正离子模式全扫描检测对化妆品提取物中的PAEs进行筛选，在最佳质谱条件下对14种PAEs标准溶液分别进行了检测，测定的各化合物准分子离子的精确质量数相对偏差均小于5.0×10-6,完全能满足基于精确质量数筛查的分析要求。

2.3 方法学评价

2.3.1线性关系及检出限高分辨质谱提取的是精确质量数，提取色谱图噪音几乎可以忽略，以信噪比(S/N)计算的检出限和定量限与方法的真实性能可能存在差距。因此，本实验用空白基质(以乳膏类样品基质为例)提取液逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度，换算为方法的检出限，以消除基质干扰的影响。将14种PAEs化合物的标准溶液用基质空白提取液稀释成合适浓度的系列标准工作液，以化合物浓度和峰面积绘制标准曲线，得到各化合物的线性范围和检出限等见表2。

表2 14种PAEs化合物线性范围、相关系数和检出限

2.3.2回收率采用水剂、乳液和油剂空白化妆品样品中分别添加低、中、高3个水平(DPhP和DEP为0.5 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg；DNOP和DHXP为0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、1 mg/kg；其余均为0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.5 mg/kg)的混合标准溶液，进行加入回收试验，每个添加水平平行测定6次，采用基质标准工作曲线定量，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。结果表明14种PAEs的平均回收率为70.8%～111.6%，RSD为1.5%～9.7%。在最佳仪器条件下，14种PAEs的仪器检出限在0.05～0.5 mg/kg范围内，虽然较XU等[15]采用三重四极杆质谱的灵敏度差，但是完全能满足化妆品实际样品中PAEs的快速筛选鉴别要求。

表3 空白化妆品中14种PAEs化合物的添加回收率(n=6)

3 化妆品中PAEs精确质量数快速筛查和鉴别

对于化妆品中的PAEs的分析，低分辨质谱法由于检测质量精度低，无法排除杂质的干扰，可能会导致假阳性。而高分辨质谱能提供化合物精确质量数，并且可通过保留时间和二级碎片离子的精确质量数确认，大大降低假阳性的出现率，从而显著提高方法的选择性。本实验通过准分子离子的精确质量数对UPLC-LTQ Orbitrap MS分析得到的一级全扫描总离子流图进行各化合物信号提取，以实现化妆品提取物中各种PAEs的快速筛选。Orbitrap静电场轨道阱质谱(Orbitrap MS)是一种新兴的高分辨质谱技术，可以提供较高的选择性并且可以在全扫描模式下以较小的质量窗口提取离子。小的质量窗口可以显著减小背景噪音、提高信噪比，并且降低了错误结果的发生[22]。下面以用本研究建立的方法对实验室检测到的一种精油类化妆品中的DEP为例，介绍筛选及鉴别的过程。

图2 样品中DEP的提取离子色谱图(a)、一级全扫描质谱图(b)、二级CID质谱图(c)和标准溶液中DEP的二级CID质谱图(d)Fig.2 Extracted ion chromatogram(a),full-scan accurate mass spectrum(b),CID mass spectrum of DEP in a sample(c) and CID mass spectrum of DEP in standard solution(d)

香薰精油化妆品提取液采用UPLC-LTQ/Orbitrap MS进行分析，获得ESI+总离子流图，然后通过DEP的准分子离子的精确质量数对一级全扫描总离子流图进行信号提取，离子提取窗口宽度为5.0×10-6，通过信号提取得到图2a，图2a中有一个明显的提取离子色谱峰，保留时间为9.01 min，对应的质谱图见图2b，可以看出图2b中有明显的m/z223.09702的[M+H]+峰，实测值与理论值相比，精确质量数相对偏差为2.38×10-6，符合欧盟相关法规[23]对高分辨质谱定性确认的精确质量数相对偏差要求(<5.0×10-6)。由此可见，通过高分辨质谱精确质量数信息筛选，可满足对化妆品中PAEs快速筛查及鉴别的分析要求。对疑似阳性样品，除了通过精确质量数和保留时间筛选外，还可根据二级碎片离子进行确认。对比标准溶液的二级质谱图(图2c)和实测样品的二级质谱图(图2d)，发现各碎片离子以及离子相对丰度也基本一致，且各主要碎片离子的精确质量数相对偏差也在5 .0×10-6以内。参照欧盟2002/657/EC[24]中对质谱定性的相关规定：高分辨质谱母离子可获得的识别点数是2.0，高分辨质谱子离子可获得的识别点数是2.5，而通过采用DEP的一级母离子和二级CID碎片离子的精确质量数进行样品定性，可获得大于7个识别点的定性分数，已远远超出了欧盟2002/657/EC对禁用药物确认需要最少4个识别点的规定。因此，通过保留时间、精确质量数即可对PAEs化合物进行快速筛查。筛查出的阳性样品再经离子阱的二级谱图扫描，通过二级特征碎片离子进行定性确证。

运用本研究建立的UPLC-LTQ Orbitrap MS高分辨质谱法结合精确质量数筛选，对进口及国产的香水类、霜膏类、精油类等不同类型的化妆品样品共50份进行了分析测定，并采用保留时间比对和离子阱的多级质谱分析进行了定性确认。结果显示：在1种霜膏类样品和2种精油类样品中含有DEP；3种霜膏类样品中含有DIBP和DBP；1种霜膏类样品和1种精油类样品中含有DEHP。由以上结果可以看出，本研究建立的基于精确质量数筛选的UPLC-LTQ Orbitrap MS高分辨质谱法是快速鉴别化妆品中PAEs的有效方法。