修饰丝网印刷电极的制备及抑郁小鼠大脑和血液样品中5-羟色胺含量的测定

陈玉玲, 麦婉莹, 王玉婷, 方旖旎, 张 淼, 王 诗, 丁 虹*

(1.武汉大学药学院，湖北武汉 430072；2.湖北科技学院药学院，湖北咸宁 437100)

5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)是机体重要的神经介质之一，其受体在中枢神经系统均有分布。研究表明，5-HT与抑郁症的生成密切相关[1]，因此，测定人体内5-HT的含量具有重要意义。而氟西汀作为5-HT再摄取抑制剂已被广泛用于抑郁症的临床治疗。目前生物样品中5-HT的检测方法主要有伏安法、毛细管电泳法、高效液相色谱法(HPLC)、色谱质谱联用法等，其中最常用的是HPLC。但这些方法的样品处理过程都较复杂，成本高，对仪器设备的要求较高，而且费时[2]。近年来，电化学方法因操作简单、检测速度快等优点而得到广泛的应用[3 - 6]。与传统三电极系统相比，丝网印刷电极具有批量化、小型化、成本低及一次性等特点[7 - 11]。

本研究制备了多壁碳纳米管-壳聚糖纳米复合材料(Multi-walled Carbon Nanotubes and Chitosan Nano-composites,MWCNTs-CHIN)修饰丝网印刷电极(SPE)，通过循环伏安法(CV)及方波伏安法(SWV)考察了5-HT在MWCNTs-CHIN/SPE上的电化学特性,并应用于经慢性不可预见性应激抑郁模型(CUMS)造模的抑郁小鼠大脑和血液样本中5-HT水平的测定。该方法操作简单、测定快速，样品无需复杂前处理，可用于大批量实际样品中5-HT含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及受试动物

EC570电化学工作站(高仕睿联)；手动丝印台(武汉三才印刷器材有限公司)；pH计(北京哈纳科仪科技有限公司)；PS-10A超声波清洗器(香港节康超声波有限公司)；紫外固化机(保定荣达电子设备有限公司)；烘箱(上海申光仪器仪表有限公司)，扫描电镜(荷兰，FEI公司)。

5-羟色胺标准品(Sigma公司)；MWNTs(中国科学院成都有机化学研究所)；壳聚糖(科瑞生物)；丝印碳油墨(Acheson公司)；银油墨(Acheson公司)；Ag/AgCl油墨(徐州英剑纳米科技有限公司)；绝缘油墨(日本JUJO公司)；PVC片材(上海新立医疗器械有限公司)，其他试剂均为分析纯。实验用水均为二次蒸馏水。

盐酸氟西汀片(批号：2079A，礼来苏州制药有限公司生产，临用前配制成混悬液)。雄性昆明小鼠，体重20～25 g，购自湖北省疾控中心，实验前小鼠适应环境一周。

1.2 实验方法

图1 (A)丝网印刷电极(a -PVC板,b -银导轨,c -参比电极,d-工作电极,e -辅助电极,f-绝缘层)；(B)丝网印刷电极的测定图Fig.1 (A)Preparation process of screen printed electrode (a -PVC sheets;b -Ag leads;c -reference electrode;d-working electrode;e -auxiliary electrode;f-insulation layer);(B)Determination of 5-HT

1.2.1MWNTs-CHIN/SPE的制备丝网印刷的基本原理[9,10]是丝网印版图像部分的网孔能够透过印料漏印在承印物上，印版上其余部分网孔堵死不能透过油墨，因此在承印物(如PVC片材)上形成空白。银油墨用来印刷制作电极的导轨，碳油墨用来印刷制作辅助电极和工作电极，Ag/AgCl油墨用来印刷制作参比电极。依次印刷银导轨、工作电极、辅助电极、参比电极后，置70 ℃ 烘箱中烘干，最后印刷绝缘层，紫外烘干[9 - 13]。先用2 g/L MWNTs对工作电极进行修饰，晾干，再滴加0.5% CHIN，晾干后低温保存备用。丝网印刷电极结构如图1A所示，其测定图见图1B。

1.2.2抑郁小鼠模型建立及样品制备参照文献方法[14 - 17]，采用慢性不可预见性应激抑郁模型(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)，对受试小鼠予以夹尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、45 ℃ 热烘(5 min)、昼夜颠倒(24 h)、4 ℃ 冰水游泳(5 min)、水平振荡(30 min)等方法随机刺激21 d。分别在7 d、14 d、21 d对小鼠进行行为学评价，并处理小鼠。取其新鲜血液，离心取血浆，用两倍体积的甲醇沉蛋白，离心取上清，制成血样。取其大脑组织，加入其4倍体积的生理盐水并匀浆，用匀浆液两倍体积的甲醇沉蛋白，离心取上清，将甲醇吹干即制成脑样。血样和脑样均冷冻保存备用。

1.2.35-HT的测定方法采用电化学工作站，以MWNTs-CHIN/SPE测定5-HT，电解液为含不同浓度5-HT的Tris-HCl缓冲溶液(pH=7.5)。在-0.20～0.80 V(vs.Ag/AgCl)范围内分别进行循环伏安法(CV)和方波伏安法(SWV)扫描，测定多个不同浓度的5-HT，确定5-HT峰电流与其浓度的关系，绘制标准曲线，并用该方法测定上述样品中5-HT含量。

图2 裸丝网印刷电极(A)、MWNTs修饰丝网印刷电极(B)和MWNTs-CHIN修饰丝网印刷电极(C)的扫描电镜(SEM)图Fig.2 SEM images of bare SPE(A),MWNTs/SPE(B)and MWNTs-CHIN/SPE(C)

2 结果与讨论

2.1 5-HT的电化学特性

2.1.1电极表征通过扫描电镜(SEM)分别对裸丝网印刷电极和修饰丝网印刷电极(MWNTs/SPE,MWNTs-CHIN/SPE)进行表征，如图2所示。结果显示，裸丝网印刷电极表面的碳墨颗粒相互间关联较少，整体结构疏松，凹凸不平，不利于5-HT的富集，导致响应信号不够明显；而MWNTs/SPE表面有大量的碳纳米管，结构较裸电极紧密，具有良好的导电性，但同时由于碳纳米管在电解池体系中易脱落，导致电极不稳定，影响5-HT检测的准确性。而MWNTs-CHIN/SPE表面有较大的比表面积，且壳聚糖在电解池体系中易成膜，有利于5-HT在电极表面的富集，促进电子转移，催化电化学反应，从而提高响应信号。因此选用MWNTs和CHIN共同修饰的丝网印刷电极进行5-HT含量的测定。

2.1.25-HT在MWNTs-CHIN/SPE上的电化学特性采用循环伏安法(CV)和方波伏安法(SWV)分别考察了5-HT在裸丝网印刷电极、MWNTs/SPE和MWNTs-CHIN/SPE上的电化学特性。结果显示(图3A)，在-0.20～0.80 V电位范围内，只出现1个氧化峰，表明5-HT在丝网印刷电极上有电化学活性。进一步用SWV法进行测定(图3B)，可观察到裸丝网印刷电极在0.30 V处的峰较小(曲线a)，不易观察；而MWNTs/SPE和MWNTs-CHIN/SPE在0.30 V的峰较为明显，MWNTs-CHIN/SPE(曲线c)的氧化还原峰信号明显强于MWNTs/SPE(曲线b)，且5-HT在一定浓度范围内与响应峰电流呈线性相关，可用于5-HT的测定。研究结果表明经MWNTs-CHIN共同修饰后，丝网印刷电极具有更好的导电性及较大的比表面积，从而提高了5-HT的氧化峰电流。

图3 10 μmol/L 5-HT在不同电极上的循环伏安曲线(A)和方波伏安曲线(B)Fig.3 Cyclic voltammetric curves(A) and square wave voltammetric curves(B) of 10 μmol/L 5-HT at different electrodes (a) SPE;(b)MWNTs/SPE;(c)MWNTs-CHIN/SPE.

2.2 实验条件对5-HT电化学信号的影响

2.2.1缓冲溶液的选择考察了在NaAc-HAc、PBS、Tris-HCl、柠檬酸-NaAc等缓冲溶液中5 μmol/L 5-HT在MWNTs-CHIN/SPE上的电化学响应。结果显示，当缓冲溶液为 Tris-HCl 时，5-HT的峰电流最大，灵敏度最高。故选择 Tris-HCl为缓冲溶液。

2.2.2缓冲溶液pH值的影响考察了在不同pH值(6.0～9.0)Tris-HCl 缓冲溶液中5 μmol/L 5-HT在MWNTs-CHIN/SPE上的电化学响应。结果表明，当Tris-HCl 缓冲溶液的pH值为6.0～7.5 时，5-HT 的峰电流随着缓冲溶液pH值的增大而增大；当Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.5～9.0 时，5-HT的峰电流随着缓冲溶液pH值的增大而减小；即当缓冲溶液pH值为7.5时，5-HT峰电流最大，灵敏度最高(图4)。故选择pH=7.5的Tris-HCl 溶液为最佳缓冲溶液。

2.2.3扫描频率的确定考察了不同扫描频率(10、15、20、25、30、35、40 Hz)下5-HT的SWV图。由图可知，随着扫描频率的增加，5-HT的峰电位略微负移，峰电流逐渐增大，考虑其峰形及峰电流，选择扫描频率为25 Hz进行测定。

2.2.4富集时间的影响测定了富集时间分别为0、1、2、3、4、5 min时5-HT的SWV图，如图5。结果显示，在前3 min，随着富集时间的延长，5-HT的氧化峰电流逐渐增加，3 min后峰电流基本保持不变。结合反应时间和灵敏度，选择开路富集时间为3 min。

2.3 工作曲线和检出限

采用SWV法，在优化条件下对5-HT进行测定，如图6。结果显示，在0.01～1.00 μmol/L范围内，5-HT的峰电流与其浓度呈良好的线性关系，线性方程为：I(μA)=3.7699c(μmol/L)+0.2319，相关系数R=0.9969，检出限(S/N=3)为0.005 μmol/L。

图4 缓冲溶液pH对5 μmol/L 5-HT在MWNTs-CHIN/SPE上峰电流的影响Fig.4 Effect of buffer pH on peak current of 5 μmol/L 5-HT at MWNTs-CHIN/SPE

图5 富集时间对5 μmol/L 5-HT在MWNTs-CHIN/SPE上峰电流的影响Fig.5 Effect of pre-concentration time on peak current of 5 μmol/L 5-HT at MWNTs-CHIN/SPE

图6 测定5-HT的方波伏安曲线；内插图为5-HT的标准曲线Fig.6 Squre wave voltammetric curve of 5-HT;Inset:The standard curve of 5-HTa→h:0,0.010,0.020,0.050,0.100,0.200,0.500,1.000 μmol/L 5-HT,respectively.

2.4 干扰实验

考察了生物体内常见的有机物和离子对5-HT测定的影响。研究结果表明，5 μmol/L 多巴胺(DA)在0.07 V处有氧化峰，100 μmol/L 尿酸(UA)在0.15 V处有氧化峰，250 μmol/L 抗坏血酸(AA)及250 μmol/L葡萄糖不出峰，而5-HT在0.30 V处出峰，即DA、UA、AA及葡萄糖等不干扰5-HT的测定；其他100倍的金属离子如Zn2+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+无氧化还原峰，基本上不干扰5-HT的测定(误差<5.00%)。

2.5 抑郁小鼠大脑和血液中5-HT含量的测定

用CUMS法建立小鼠抑郁模型，分别在第7 d、14 d、21 d对其进行行为学评价，如表1和表2所示，模型组在旷场试验中的水平和垂直活动得分均显著低于空白组(P<0.05)，同时，模型组的游泳不动时间显著高于空白组(P<0.05)，说明造模成功。

表1 小鼠旷场试验的测定结果

Compared with CUMS,*P<0.05,**P<0.01.

表2 小鼠游泳不动时间的测定结果

Compared with CUMS,*P<0.05,**P<0.01.

测定小鼠脑样及血样的加标样品的标准曲线，在0.01～1.00 μmol/L浓度范围内呈线性，其线性方程为：I(μA)=4.4703c(μmol/L)+0.0348，相关系数R=0.9982，检测限(S/N=3)为0.010 μmol/L，加标回收率为90.1%～112.0%，相对标准偏差(RSD)<5.0%。用上述建立的方法和高效液相色谱法(HPLC)同时测定小鼠大脑和血液样品中5-HT的含量，如表3和表4所示，用丝网印刷电极和HPLC两种方法均测得空白组和氟西汀组的5-HT含量明显高于模型组，同时，上述两种方法测得的5-HT含量相当，说明丝网印刷电极电化学法测定5-HT的方法准确可行。

表3 小鼠大脑中5-HT含量测定结果(n=5)

Compared with CUMS,*P<0.05,**P<0.01.

表4 小鼠血样中5-HT含量测定结果(n=5)

Compared with CUMS,*P<0.05,**P<0.01.

3 结论

本文成功地将MWNTs和CHIN共同修饰在丝网印刷电极表面，制备了修饰丝网印刷电极，并建立了快速测定抑郁小鼠大脑和血液样品中5-羟色胺含量的电化学分析新方法。该方法简单、快捷，且电极制作成本低，所需仪器简单，样品不需预处理，用于大脑和全血中5-羟色胺含量的测定结果满意，可作为一次性测试条使用，为5-羟色胺检测走入小型化、家庭化提供了实验基础。