高效液相色谱-荧光检测法测定螺旋藻中苯并[a]芘残留

郑香平， 张 春， 丁立平， 吴文凡， 林 埔

(1.福清出入境检验检疫局,福建福清 350300；2.福建中医药大学药学院,福建福州 350122)

螺旋藻(Spirulina)又名蓝藻，因其富含优质蛋白质、多种维生素及生物活性物质，正日益受到人们的广泛重视[1 - 4]。但是近年来我国出口到欧盟的螺旋藻及其相关产品由于苯并[a]芘超标问题遭遇多次通报。欧盟等国规定螺旋藻片剂中苯并[a]芘小于2 μg/kg，螺旋藻粉中苯并[a]芘小于10 μg/kg。因此，建立测定螺旋藻中苯并[a]芘的方法具有重要的意义。

苯并[a]芘是一种常见的多环芳烃类高活性致癌物质。螺旋藻的苯并[a]芘除了来源于环境污染外，还可能在螺旋藻高温烘干等过程中产生[5,6]。近年来，出现很多对粮油、水产品、烧烤肉制品、蔬菜等基质中苯并[a]芘的残留检测旳研究报道[7 - 16]。但尚无螺旋藻基质中苯并[a]芘残留检测的报道。本文采用高效液相色谱-荧光检测法对螺旋藻中苯并[a]芘的残留量进行分析测定，检出限为0.12 μg/kg，定量限为0.40 μg/kg。该方法样品预处理简单，测定结果准确可靠，可为螺旋藻中苯并[a]芘的质量控制提供保障。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)，配备四元梯度泵、自动进样器、荧光检测器(FLD)和化学工作站；BP211D十万分之一电子天平(北京赛多利斯公司)；Millipore超纯水系统(美国，Millipore Synergy公司)；固相萃取装置(美国，Waters公司)；旋转蒸发仪(德国，IKA公司)；SHZ-82A恒温振荡器(常州澳华仪器有限公司)；TurboVap LV氮气浓缩装置(瑞典，Biotage公司)；3K-15低速冷冻离心机(德国，Sigma公司)；6 mL Alumina-N固相萃取柱。

苯并[a]芘标准贮备溶液：准确称取苯并[a]芘标准品(纯度≥98.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)0.0050 g，用乙腈溶解，定容于50 mL容量瓶中，配成100 μg/mL的标准贮备液，0～4 ℃低温保存，使用时根据需要以乙腈-水(85∶15，V/V)配成标准工作溶液。乙腈为色谱纯(德国默克公司)；正己烷、环己烷、甲醇、丙酮、二氯甲烷均为分析纯(国药集团)。水为超纯水(18 MΩ·cm)。

1.2 实验方法

1.2.1样品提取称取粉碎的螺旋藻样品1.00 g 于50 mL 离心管中，加25 mL 正己烷，置于37 ℃恒温振荡器上振荡提取30 min，以4 000 r/min离心5 min，将上清液转移至150 mL梨形瓶中，残渣用25 mL 正己烷重提1次，合并提取液，于40 ℃旋转蒸发至近干，取下梨形瓶，待净化。

1.2.2固相萃取先后使用3 mL 二氯甲烷、5 mL正己烷在流速约2 mL/min条件下活化固相萃取(SPE)柱。将提取液转入SPE柱中，再用2 mL正己烷清洗梨形瓶，转入柱中，重复洗涤3次。用10 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液洗脱，洗脱液收集于10 mL离心管中，氮气吹至近干。准确移取1.0 mL乙腈-水(85∶15，V/V)定容，过0.22 μm滤膜，按仪器工作条件进行测定。

1.2.3色谱条件色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250×4.6 mm i.d.，5 μm)；流动相为乙腈-水(85∶15,V/V)；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；柱温：35 ℃；荧光检测器检测：激发波长370 nm，发射波长425 nm。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

图1 不同提取溶剂提取螺旋藻的色谱图Fig.1 The chromatograms of Spirulina extracted with hexane (a),acetone (b) and acetonitrile (c)

据文献报道[8 - 10]，苯并[a]芘可用苯、正己烷、环己烷、甲醇、乙腈、丙酮等非极性或中等极性有机溶剂提取。其中，用苯作提取溶剂效果最好，但苯为致癌物质，对人体伤害大，也容易造成二次污染。本实验比较了正己烷、环己烷、甲醇、乙腈、丙酮对苯并[a]芘的提取效果。5种有机溶剂均能将螺旋藻中的目标物提取出来。其中，正己烷、乙腈、丙酮的提取效果较好，回收率均大于90%。但以丙酮、乙腈作为提取溶剂时，提取液颜色深，螺旋藻中极性较大的色素等杂质同时也被提取。而以正己烷作为提取溶剂时，只有少部分的色素进入提取液，提取液颜色浅。从图1可以看出，用丙酮、乙腈作为提取溶剂时，4 min和18 min左右的杂质峰明显比用正己烷为提取溶剂的大。因此，本实验采用正己烷作为提取溶剂。

2.2 固相萃取条件的选择

螺旋藻提取液中的色素较多，活性炭虽对色素有较好的吸附，但会对苯并[a]芘产生不可逆吸附，故不宜使用。考虑到中性Al2O3对色素亦有较好的吸附，本实验选用中性Al2O3SPE柱对样品进行净化。

分别比较了10 mL二氯甲烷、正己烷及体积比分别为25∶75、50∶50、75∶25的正己烷-二氯甲烷为洗脱剂对螺旋藻空白样品添加1 μg/kg苯并[a]芘的洗脱效果。结果表明，采用正己烷-二氯甲烷混合溶液(75∶25，V/V)进行洗脱效果最好。进一步考察不同体积正己烷-二氯甲烷混合溶液(75∶25，V/V)对螺旋藻空白样品添加1 μg/kg苯并[a]芘洗脱效果。结果表明，10 mL洗脱溶液时目标物的回收率已达到最大。实验选择的固相萃取条件为：采用中性Al2O3SPE柱， 以10 mL正己烷-二氯甲烷混合溶液(75∶25，V/V)为洗脱液洗脱，洗脱液40 ℃水浴氮吹浓缩至近干，用乙腈-水(85∶15)定容至1.0 mL，在选定的色谱条件下测定。

2.3 液相色谱条件的选择

固定荧光发射波长λem=420 nm，对苯并[a]芘标准溶液在激发波长λex在250～500 nm范围进行扫描，苯并[a]芘在300、370、385 nm有特征峰，300 nm和385 nm的峰有干扰，370 nm处响应值较强，且无干扰峰，选定λex=370 nm。同样对苯并[a]芘标准溶液在发射波长λem在250～500 nm范围扫描，在406、425 nm处有特征峰，而425 nm处响应值最大，且干扰峰少，因此选择λex=370 nm，λem=425 nm。比较体积比分别为70∶30、85∶15、90∶10、95∶5的乙腈-水为流动相的分离效果，结果表明乙腈比例较大时洗脱能力较强，可以缩短苯并[a]芘的保留时间，但是基线漂移较大，且与样品中其它杂质峰发生重叠，减小乙腈比例，基线相对平稳，可以改善样品溶液中各个色谱峰的分离度，却延长了苯并[a]芘的保留时间，分析操作费时。本文还改变流动相流速，对其从0.5～2.0 mL/min之间进行实验，发现流速过低会导致峰拖尾现象严重，流速太高又造成柱压过高，对色谱柱伤害较大。综合考虑上述因素，液相色谱条件为：荧光检测器激发波长λex=370 nm，发射波长λem=425 nm，流动相为乙腈-水(85∶15，V/V)，流速1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：20 μL。

2.4 方法学评价

图2 苯并[a]芘(a)、样品(b)及加标样品(c)(加标水平为1 μg/kg)的色谱图Fig.2 Chromatograms of benzo[a]pyrene (a),blank sample (b) and spiked 1 μg/kg sample(c)

2.4.1方法的线性范围和检出限、定量限在本实验所确定的实验条件下，以色谱峰面积和苯并[a]芘的标准溶液浓度作图，在0～20 ng/L浓度范围内呈良好线性关系，相关系数为0.9999。方法的检出限(S/N=3)为0.12 μg/kg，定量限(S/N=10)为0.40 μg/kg。

2.4.2方法的准确度和精密度采用螺旋藻空白样品，进行加入回收和精密度实验，样品添加3 个不同浓度的标准溶液，按本方法进行处理和测定，外标法定量。1 μg/kg、2 μg/kg 和10 μg/kg添加水平的平均回收率为96.60%～101.2%(每个添加浓度平行测定6次)，相对标准偏差为1.38%～5.68%，结果见表1。螺旋藻的空白样品和加标色谱图见图2。

表1 螺旋藻中苯并[a]芘的平均回收率和相对标准偏差(n=6)Table 1 Average recoveries，relative standard deviation of benzo[a]pyrene in spiked samples(n=6)

3 结论

本实验采用正己烷为提取溶剂对螺旋藻样品进行提取，中性Al2O3SPE柱净化，洗脱溶液为10 mL正己烷-二氯甲烷(75∶25,V/V)混合溶液，提取液浓缩后，用高效液相色谱-荧光检测法检测，外标法定量。本方法样品预处理简单，分离效果好，且方法准确，灵敏度，重复性好，检出限为0.12 μg/kg，定量限为0.40 μg/kg，满足对苯并[a]芘最大残留限量的要求。