液液微萃取-气相色谱/质谱法测定黄酒麦曲中挥发性酸及香草醛

莫新良， 徐 岩， 范文来

(1.浙江工业职业技术学院，浙江绍兴 312000；2.江南大学酿酒科学与酶技术中心酿酒微生物与应用酶学实验室，教育部工业生物技术重点实验室，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122)

黄酒是我国的一种传统发酵酒，因其营养丰富且风味独特而深受人们喜爱。麦曲是黄酒酿造的动力，是黄酒发酵的糖化发酵剂，具有“糖化、发酵、生香”功能，被称作“酒之骨”[1]。通常来说，黄酒风味的好坏很大程度上由麦曲质量的优劣决定，而麦曲的风味香气成分直接影响麦曲的质量[2]。传统的提取固体基质中香气物质的方法有索氏提取[3]，但具有消耗大量溶剂、费时及效率低等缺点。为此，研究者们开发了分析固体样品的新技术，如加压溶剂提取[4]、微波辅助提取[5]和超声辅助提取[6]等。其中，超声提取技术具有省时、无需加热及高得率等优点，能够加速固体基质中成分的浸出、提取[7]。

麦曲挥发性香气成分含量甚微，需要先对样品进行浓缩预处理。常见的有：液-液萃取法[8]、固相萃取法[9]、固相微萃取(SPME)法[10]等。其中，SPME法在食品行业的应用较为广泛。本课题组曾用SPME-气/质(GC/MS)联用方法系统地分析了麦曲中的香气物质。尽管SPME法具有非常多的优点，但对麦曲中一些极性极强的物质，如挥发性酸及香草醛等物质的萃取效果却不尽人意，有些挥发酸即使能被检测出，但回收率很低[10]。目前，对食品中有机酸的分析应用较多的有高效液相色谱法[11]和气相色谱法[12]。液-液微萃取法通过少量的溶剂一步萃取，能够快速地萃取基质中的强极性物质[13,14]。本研究采用超声提取和液-液微萃取富集，并结合GC-MS法实现了快速分析黄酒麦曲样品中挥发性酸及香草醛。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂及材料

Agilent 6890-5973气-质联用仪(美国，Agilent公司)；J-E高速冷冻离心机(美国，Beckman公司)；MPS2自动进样器(德国，Gerstel公司)；D -78224超声水浴清洗器(德国，Elma公司)。

标准品：乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、香草醛和2-丙烯酸均为色谱纯(纯度>99%)，4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮为色谱纯(纯度>98%)，均购自美国Sigma-Aldrich公司。NaCl、CaCl2、(NH4)2SO4、二氯甲烷和乙醚为分析纯，购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。无水乙醇为色谱纯，购于美国TEDIA试剂公司。实验用水为Milli-Q超纯水。

黄酒麦曲样品均由黄酒厂提供，包括传统脚踏曲(JT)和机制麦曲(JX)。来自浙江地区的3个厂家的麦曲样品分别命名为ZJ-1-JT、ZJ-1-JX、ZJ-2-JX、ZJ-3-JX；江苏地区的2个厂家的麦曲分别名为JS-1-JX、JS-2-JX；上海地区的麦曲分别命名为SH-JT、SH-JX。

1.2 实验方法

1.2.1标准溶液的配制准确称取一定量上述标准品，用无水乙醇配制得到混合标准储备液，储存于4 ℃ 冰箱中备用。再取一定量混合标准储备液加入到模拟麦曲中，配制成系列浓度梯度的混合标准溶液。内标溶液为2-丙烯酸和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮，用无水乙醇配制，浓度分别为8.71 mg/L和155.5 μg/L。模拟麦曲采用煮沸的超纯水配制，用乳酸将pH值调整到6.4。

1.2.2样品前处理取10 g麦曲样品，加入0.1 g CaCl2和20 mL 10%乙醇，超声浸提30 min，以8 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液，重复两次，合并上清液，取20 mL于50 mL离心管中，加9.0 g(NH4)2SO4和10 μL浓度分别为8.71 mg/L和155.5 μg/L的2-丙烯酸和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的混合内标溶液，用1 mL重蒸乙醚溶剂萃取，吸取有机相，用于GC-MS分析。

1.2.3GC-MS分析GC条件：CP-Wax色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度为250 ℃；进样量1 μL，不分流进样；载气He，流速2 mL/min；升温程序：80 ℃保持2 min，以10 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持15 min。MS条件：EI电离源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃；质谱检出溶剂延迟180 s，质量扫描范围30～550 amu，采集频率100 spectrums/s。

2 结果与讨论

2.1 超声提取参数的优化

2.1.1超声时间的选择实验分别选择0、10、20和30 min四个不同的超声时间来考察其对麦曲中香气物质浸提的影响。结果发现，随着超声时间的延长，挥发性物质的峰面积相应增加，但两者并不呈线性关系，当超声时间超过30 min后，挥发性物质的峰面积并未增加相反有所下降，故本实验选择30 min超声时间为最佳浸提时间。

2.1.2乙醇浓度的选择溶剂对麦曲香气物质的浸提和后续的萃取有很大的影响作用。分别选取0、10%和20% 3个不同浓度的乙醇溶液对麦曲进行浸提后，用乙醚进行液-液微萃取。结果表明，当乙醇浓度为10%时，萃取效果最好。

2.2 液-液微萃取参数的优化

2.2.1萃取溶剂的选择由于所要分析的挥发性酸及香草醛均为极性较强的物质，根据“相似相溶”原理，考察了极性较强的溶剂如乙醚、二氯甲烷和乙醚∶二氯甲烷=1∶1(V/V)的混合溶剂对各成分萃取效果的影响(取峰面积值做比较)。结果表明，乙醚对香气成分萃取效果比乙醚∶二氯甲烷=1∶1(V/V)和二氯甲烷好。因此，选择乙醚作为萃取溶剂。

2.2.2盐种类及离子强度对萃取效果的影响在萃取复杂样品基质中的挥发性物质时，常利用盐析效应来提高萃取效果。本研究考察了样品中添加NaCl和(NH4)2SO4，或不添加盐类的影响。结果显示，添加了盐后总的吸附结果明显优于未添加盐的结果，添加(NH4)2SO4时效果最佳。由于不同离子强度的盐析效果影响较大，因此比较了(NH4)2SO4浓度分别为35%、45%和55%时的萃取效果。发现加入45%(NH4)2SO4时所有物质的萃取效果最佳。

2.2.3萃取溶剂体积的选择当萃取溶剂乙醚的体积为1 mL时，为合适回收有机相及自动进样的体积，而当体积小于0.8 mL时，由于存在少量的乳化现象而使乙醚有机相的回收比较困难。因此，选择1 mL 乙醚进行液-液微萃取。

2.3 挥发性酸和香草醛的总离子流色谱图及定量离子的选择

采用全扫描的方式(SCAN)对麦曲及标样中挥发酸及香草醛进行检测，其总离子流色谱图见图1。为消除其它杂质峰的干扰，采用选择特征离子的方法(SIM)对标准品和麦曲样品中的相应化合物进行扫描，化合物的选择离子和定量离子的结果见表1。

图1 挥发酸及香草醛标样总离子流色谱图(A)和麦曲样品(B)的总离子流色谱图 Fig.1 Total ionic chromatograms of the standards mixtures of organic acids and vanillin(A) and Wheat Qu sample (B)meanings of number 1-14 were the same as those described in Table 1.

2.4 标准曲线、检出限及定量限

配制一系列浓度梯度的有机酸及香草醛混合标准溶液，对8个不同浓度梯度的混合标准溶液的每个浓度水平进行3次重复测定，所得数据取3次的平均值。根据内标标准曲线法，以标准物质和内标物质的峰面积之比(y)为纵坐标，以二者的浓度之比(x)为横坐标，得到化合物标准曲线的回归方程，检出限和定量限等，结果见表1。

表1 挥发酸和香草醛的选择离子、定量离子、标准曲线、线性相关性系数、回收率、相对标准偏差、检出限及定量限Table 1 Selected ions,quantative ions,calibration curves,correlation coefficients(R2),recoveries,relative standard deviations(RSDs),limits of detection(LODs) and limits of quantification(LOQs) of organic acids and vanillin

由表 1 可知，方法所定量的化合物的标准曲线的线性较好，线性相关系数R2在0.9988～0.9997之间。化合物的回收率在85.2%～109.2%之间，相对标准偏差(RSD)均在10%以内，说明方法的准确度和 精密度较好，适于微量成分的分析。检出限和定量限范围分别为1.5～71.8 μg/L和5.0～237.7 μg/L，可满足麦曲中相应化合物的定性定量分析要求。

2.5 实际麦曲样品中挥发酸及香草醛的定量分析

用本方法分别对来自江浙沪不同地区黄酒厂生产的麦曲样品进行检测，结果见表2。由表2可以看出，不同麦曲之间挥发酸及香草醛的含量差异较明显。经分析发现，脚踏自然生麦曲ZJ-1-JT、SH-JT等中的挥发性有机酸及香草醛的总含量(含量在39 309.7～69 694.6 μg/kg)均高于机械自然生麦曲中的含量(含量在17 480.8～31 891.0 μg/kg)；浙江地区麦曲中挥发性有机酸及香草醛含量高于江苏、上海地区相应工艺生产的麦曲中的含量。由于人工踩曲，曲坯踩制是一个重复柔制的过程，因揉挤、搓压、剪切力的共同作用，使得曲坯密而不实、松而不散、内部均匀、且通透性好，使其能产生种类较多的有益微生物且分布均匀，因而其酶系和相应的特征风味物质分布得也较为独特；而机械制曲由于一次性将曲坯压制而成，其曲坯过硬、过实、透气性差，因而导致曲中有益微生物较少、分布不太均匀，导致酶系和风味物质分布各异[15]。由于麦曲是开放性自然发酵而成，每个地域的微生物差异较大，浙江地区可能有益麦曲发酵的微生物丰富而导致其生产的麦曲中的挥发性酸及香草醛等挥发性风味成分含量高。由此不难推断挥发性酸及香草醛这类风味物质在区分不同地区不同工艺麦曲的差异中起到了非常重要的作用。

表2 不同地区麦曲中挥发性酸及香草醛的含量(μg/kg)Table 2 Contents of organic acids and vanillin in different Wheat Qu samples(μg/kg)

3 结论

建立了液-液微萃取结合气相色谱-质谱联用技术测定不同麦曲中的挥发性有机酸及香草醛的分析方法，方法快速、简便、重复性好、灵敏度高、定性定量准确。应用该方法测定了不同地区不同工艺麦曲样品，均能检测出这些挥发性有机酸及香草醛，且脚踏自然生麦曲中的挥发性有机酸及香草醛的总含量均高于机械自然生麦曲中的含量，浙江地区麦曲中挥发性有机酸及香草醛含量高于江苏、上海地区的含量。