高效液相色谱-串联质谱法测定生物样品中4,4′-二氨基-3,3′-二氯二苯甲烷残留

龚 强， 丁 利， 肖家勇， 姚碧容， 成 婧， 朱绍华， 付善良， 王利兵*

(1.湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，食品安全科学技术湖南省重点实验室，湖南长沙 410004；2.湖南省妇幼保健院，湖南长沙 410013)

当今社会化学品的应用非常广泛，但其安全问题也引起全球关注[1]。4,4′-二氨基-3,3′-二氯二苯甲烷(MOCA)是一种卤化芳香胺化学品，可以用作浇注型橡胶聚氨酯的硫化剂、胶粘剂与聚氨酯涂料的交联剂，也可用作环氧树脂的固化剂。研究表明，MOCA具有嗅觉、行为及呼吸毒性，还有潜在的致癌作用，国际癌症研究机构(IARC)将它归类为可能的致癌原(2A组)，欧盟REACH法规将其列为第6批高关注度化学品之一[2 - 5]。欧盟等国对相应违法行为的处罚也越来越严厉[6]。

目前，已报道MOCA的检测方法有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法等，检测对象主要是塑料、纺织品、食品接触材料等[7 - 10]，但没有生物样品的检测方法报道。因此，建立快速、有效地检测方法，监测高危人群体内MOCA水平，用于评价健康和环境效应意义重大。生物样品如血液、尿液等的组成较为复杂，其中蛋白质、内源性物质常高于待测成分数倍乃至数千万倍，基质干扰严重，影响方法的准确度及灵敏度[11,12]。本文通过优化样品前处理方法、色谱及质谱条件，建立了人体血液及尿液样品中灵敏度高、重现性好的MOCA快速检测方法，为高危人群的健康风险监测提供技术基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津20 A高效液相色谱仪(日本，岛津公司)，带自动进样器和柱温箱；API 4000质谱检测器(美国，AB公司)，含电喷雾(ESI)电离源和三重四级杆质量分析器；SK-1快速混匀器(金坛市富华仪器有限公司)；BRANSON型超声波清洗器(美国，必能信超声有限公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多(中国)公司)。

4,4′-二氨基-3,3′-二氯二苯甲烷(MOCA)标准品购自Dr.Ehrenstorfer(纯度>90.0%，德国Augsburg)。准确称取10 mg MOCA标准品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配成1.0 mg/mL的标准储备溶液。准确移取储备液100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成10 μg/mL的中间标准工作液，于-4 ℃冷藏储存。二氯甲烷、乙酸、甲酸为分析纯(国药集团)。乙腈、甲醇为色谱纯(德国Merk公司)。实验用水由Millipore超纯水仪制备。

1.2 样品前处理

将新鲜离体血液37 ℃水浴30 min，3 000 r/min离心10 min，分离出血清。在血清和尿液样品中加入质量浓度为0.5%的柠檬酸，防止MOCA降解，4～5 d内完成提取步骤或者置于-20 ℃长期保存。

准确吸取血清样品0.5 mL、尿液样品1.0 mL，加乙腈5.0 mL，振荡混匀2 min，14 000/min离心10 min，上清液过活化的C18柱(C18柱依次用3.0 mL甲醇、3.0 mL水过柱活化)，流速<2.0 mL/min，提取液过柱后，分别用5 mL 5%甲醇水淋洗、5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40 ℃氮气吹至近干，1.0 mL甲醇-水(1∶1，V/V)定容，过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.3 色谱及质谱条件

1.3.1色谱条件色谱柱：Agilent Eclipse AAA柱(150×4.6 mm，3.5 μm)；流动相：A相为乙腈，B相为0.1% HAc溶液，80%A+20%B等度洗脱；流速：0.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

1.3.2质谱条件离子源：电喷雾电离离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；雾化气(Gas1)：60.00 psi；辅助气(Gas2)：60.00 psi；离子喷雾电压(IS)：5 kV；气帘气(CUR)：20.00 psi；离子化温度(TEM)：450 ℃；检测方式：多反应监测扫描模式(MRM)。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

MOCA是芳香胺的一种，分子量小，极性较弱，参照文献方法[4]对流动相和色谱柱进行条件优化。分别采用乙腈、甲醇作为有机相，0.1%甲酸、0.1% HAc为水相，两两组合进行优化，结果表明，乙腈-0.1% HAc溶液为流动相时，保留时间、峰形、响应3方面综合比较最佳。另外，比较了C18柱、C8柱以及Agilent Eclipse AAA柱的分离效果，其中Agilent Eclipse AAA柱的分离峰形最好。因此选择Agilent Eclipse AAA柱，采用乙腈-0.1% HAc溶液为流动相对目标物进行分离。

利用流动注射直接进样，正离子模式扫描，优化MOCA的质谱条件。结果见表1。

表1 MRM检测MOCA的部分质谱参数Table 1 Multiple reaction monitoring parameters of MOCA

2.2 前处理条件的优化

图1 不同提取方法结合不同净化柱的回收率比较Fig.1 Recoveries of MOCA by different extraction solvents combination with different purification columns AL:basic Al2O3 column;C18:C18 column;C:carbon column;Ace:acetonitrile;Dich:dichloromethane；added concentration:10.0 ng/mL in blood samples and 5.0 ng/mL in urine samples.

生物样品中蛋白质、有机盐类等多种物质的存在，对目标物的分离、回收率以及方法的灵敏度影响较大。实验比较了乙腈、二氯甲烷2种提取方法，其中乙腈提取法回收率更高，但基质干扰较大，实验选择乙腈沉淀蛋白。进一步考察了2倍、5倍、10倍、20倍样品量乙腈对蛋白质的沉淀效果，综合考虑沉淀效果及试剂用量，选择血液样品采用10倍样品量乙腈沉淀蛋白最为理想，尿液样品采用5倍样品量乙腈沉淀蛋白。根据MOCA的特性，分别采用碱性Al2O3柱、C18柱、碳黑柱3种小柱进行净化，结果表明C18柱净化效果最好，目标物回收率最高。实验选取乙腈沉淀提取法，结合C18柱净化作为生物样品中MOCA的前处理方法。不同提取方法结合不同净化柱的回收率比较见图1。

2.3 方法的线性范围及检测限

采用空白血液和尿液基质溶液配制MOCA分别为0.3、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的标准系列溶液，按优化条件处理和测定，以峰面积(y)为纵坐标，MOCA质量浓度(x,ng/mL)为横坐标，进行回归分析，根据信噪比(S/N≥3)确定方法检测限。测定血液及尿液样品中MOCA的回归方程、相关系数、线性范围及检测限见表2。

2.4 方法的回收率和精密度

选用不含待测组分的血液及尿液样品，血液按1.0、10.0、100.0 ng/mL浓度，尿液按0.5、5.0、50.0 ng/mL浓度水平进行加入回收试验，每个添加浓度水平平行测定6次，回收率和精密度(RSD)见表3。

2.5 实际样品分析

采用优化条件对湖南省妇幼保健院100例健康体检血液及尿液样品进行检测，均未检出MOCA残留，同时对空白样品进行加入回收试验，实际血液样品及空白添加样品的色谱图如图2所示。

表2 MOCA的线性方程、线性范围、相关系数与检测限Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and limits of detection of MOCA

表3 MOCA的回收率和精密度Table 3 Recoveries and relative standard deriations(RSDs) of MOCA

图2 实际样品(a)及空白添加样品(b)的色谱图 Fig.2 Chromatograms of real sample (a) and blank added samples (b) a:blank bood sample;b:blood sample added with 10 ng/mL MOCA.

3 结论

通过对样品前处理方法、色谱及质谱测定条件进行优化，建立了血液和尿液2种生物样品中MOCA的快速检测方法。该方法灵敏度高、重现性好，样品前处理方法简便，血液和尿液样品的检测限分别可以达到0.5 ng/mL、0.3 ng/mL，远远低于文献报道的毒理实验水平，适用于MOCA高危人群的健康风险监测，为健康效应和环境效应评价提供技术基础。