高效液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠尿液中五种可能的癌症标志物

郭 岚*， 孙 玄， 鄢爱平， 柳英霞， 肖石妹， 万益群

(南昌大学化学学院，江西南昌 330047)

蝶呤类化合物属于蝶啶的衍生物，它们分布于整个生物界且种类很多，如黄蝶呤、异黄蝶呤、蝶呤-6-羧酸、新蝶呤、生物蝶呤等，但含量极微。过去三十年来，不断有研究发现肿瘤的存在会改变体液中某些蝶呤类化合物的水平，因此蝶呤类化合物成为了癌症筛查的研究热点[1 - 5]。酪氨酸和色氨酸是构成生物体的基本物质，同时也是合成生命体众多神经递质和重要化合物的前体物质，癌症患者营养不良和过度消耗会导致其代谢发生紊乱[6 - 8]。因此，研究生物体内酪氨酸和色氨酸含量的变化，对于癌症的早期诊断具有重要意义。

目前对体液中酪氨酸和色氨酸含量的测定均有研究报道，测定方法主要有高效液相色谱-荧光法[9 - 11]、毛细管电泳-荧光法[3,5,12]等。高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法结合了高效液相色谱对复杂样本的高分离性能与质谱的高选择性和高灵敏度等优势，已被广泛应用于生物样本中小分子化合物的定性定量分析[13,14]。应用HPLC-MS/MS法分别测定蝶呤类化合物和氨基酸的研究已见报道[15,16]，而将其应用于生物样本中黄蝶呤、异黄蝶呤、蝶呤-6-羧酸、酪氨酸和色氨酸同时测定的研究尚未见报道。基于此，本文采用HPLC-MS/MS法同时测定大鼠尿液中黄蝶呤、异黄蝶呤、蝶呤-6-羧酸、酪氨酸和色氨酸5种可能的癌症标志物。可为建立相应的大鼠癌症模型，实现对大鼠尿液中这5种可能的肿瘤标志物在肿瘤整个发生、发展过程中含量变化的监测研究，筛选出两种或两种以上的肿瘤标志物用于联合检测，以提高肿瘤标志物早期诊断的准确性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 6430三重串联四极杆液相色谱-质谱联用系统(美国,Agilent公司)，配Agilent l200高效液相色谱仪、电喷雾离子源和Agilent MassHunter数据处理软件；Milli-QS 超纯水器(美国，Millipore公司)；TGL-16C 高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；IKA MS3迷你振荡器(广州仪科实验室技术有限公司)。

酪氨酸和色氨酸标准品(纯度>99%，北京百灵威科技有限公司)；黄蝶呤、异黄蝶呤和蝶呤-6-羧酸标准品(纯度大于98%，美国Sigma公司)；乙腈、甲醇和甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；NaOH(质量分数为50%，美国Fisher公司)。实验用水均为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取适量的黄蝶呤、异黄蝶呤、蝶呤-6-羧酸、酪氨酸、色氨酸标准品于5个25 mL棕色容量瓶中，加入数滴0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，再用超纯水稀释至刻度，摇匀，置于4 ℃的冰箱内保存。黄蝶呤、异黄蝶呤和蝶呤-6-羧酸浓度均为100 mg/L，色氨酸和酪氨酸浓度均为500 mg/L，使用时分别用水稀释至所需浓度。

1.3 样品前处理

将采集的大鼠尿样以4 000 r/min离心20 min，以除去样品中的食物残渣和杂质。然后取500 μL尿样于5 mL离心管中，加500 μL乙腈和500 μL甲醇，在迷你振荡器上混匀1 min后，于暗处静置5 min，再以4 000 r/min离心20 min，将上清液转移到25 mL容量瓶，超纯水定容。用0.22 μm的有机相滤头过滤后，取10 μL进行高效液相色谱-质谱分析。

1.4 高效液相色谱-质谱条件

高效液相色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(100×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：甲醇∶0.1%甲酸溶液=10∶90(V/V)；流速：0.13 mL/min；柱温：25 ℃；进样体积：10 μL。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源；毛细管电压：4.0 kV；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：11 L/min；扫描范围：m/z50～250；扫描模式：正离子模式；检测方式：多反应监测模式(MRM)。5种目标化合物的质谱参数见表1 。

表1 5种碟呤类化合物质谱参数Table 1 HPLC-MS/MS parameters for five compounds

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

将5种目标物的标准溶液分别进样，流动相采用甲醇∶0.1%甲酸溶液=10∶90(V∶V)，在正离子模式下进行全扫描，扫描范围为m/z50～250，得到一级质谱图，选择响应最高的碎片离子作为母离子，一般选用分子离子作为母离子以提高选择性。选定母离子后，在60～140 V范围内分别优化其裂解电压，以得到最强的母离子信号。在此基础上，采集子离子扫描的二级质谱图，以得到产物离子信息，并优化碰撞能，选择响应值最大的2个产物离子作为定量子离子和定性子离子，建立MRM用于定性和定量。优化后的质谱测定参数见表1。

2.2 高效液相色谱条件的选择及优化

图1 混合标准溶液多反应监测(MRM)色谱图Fig.1 MRM chromatograms of standard mixture solution 1.xanthopterin;2.tyrosine;3.isoxanthopterin;4.ptoin-6-carboxylic acid;5.tryptophan.

待分析的5种化合物极性较强，在C18柱上的保留较弱，因此需选用洗脱能力较弱的流动相。为了提高样品的离子化效率，增加质谱的响应强度，需要在流动相中加入少量易挥发的酸或缓冲盐，同时也可以减少C18柱上残余的硅羟基对极性分子的次级保留效应，改善峰形。基于上述原因，本实验分别用0.1%甲酸溶液或10 mmol/L甲酸铵-甲酸缓冲溶液(pH=4.0～5.0)和甲醇，以不同比例混合作为流动相，考察了其对5种化合物的洗脱情况以及质谱响应灵敏度的影响。实验结果表明，当甲醇∶甲酸-甲酸铵缓冲溶液(pH=5.0)=10∶90(V/V)时，5种物质可以实现基线分离；而当水相为0.1%甲酸溶液时，5种物质中除了酪氨酸和黄蝶呤有部分重叠，其余3种物质均可以基线分离，色谱分离虽然不如前者，但是5种物质的质谱响应信号却达到了前者的20～60倍，这应该是甲酸的离子化效率较甲酸铵更高的缘故。考虑到质谱检测器可以通过选择不同的子离子进行检测，这样即使在色谱柱上不能完全分离，但仍可以通过质谱检测离子的不同来实现酪氨酸和黄蝶呤的同时测定，因此本实验最终选择流动相为甲醇∶0.1%甲酸溶液=10∶90(V/V)。在优化条件下，各物质的MRM色谱图见图1。

2.3 基质标准曲线与检出限

取适量的标准储备液，用流动相稀释成混合标准工作溶液系列，在优化的高效液相色谱-质谱条件下测定，以浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线。同时在空白尿液样品中加入相同浓度的标准溶液，配成基质标准溶液系列，按相同的方法测定，绘制标准加入法的标准曲线，将此标准曲线反向延长交于横坐标，则此数据的相反数为空白尿样中的待测物的浓度，再将此浓度与加标浓度相加得到加标后尿样中待测物的总浓度，以总浓度(c)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，进行线性回归，得到基质标准曲线。基质标准曲线与溶剂标准曲线的线性回归方程和相关系数见表2，两者的斜率比值可以反映基质干扰作用的强弱。由实验结果可知，除了蝶呤-6-羧酸，其余4种化合物均存在较强的基质干扰效应，因此必须要配制基质标准曲线进行定量分析。以3倍的信噪比求得黄蝶呤、异黄蝶呤、蝶呤-6-羧酸、酪氨酸和色氨酸仪器检出限分别是1.6、1.5、2.2、0.9和1.0 ng/mL。

表2 基质标准曲线和溶剂标准曲线Table 2 The matrix-matched standard curves and solvent-matched standard curves

2.4 回收率和精密度试验

取对照组和膀胱癌模型组大鼠尿样进行回收率和精密度试验，根据大鼠尿样中5种待测物的本底浓度，分别添加3个不同浓度水平的标准溶液，每个水平平行测定5次，结果见表3和表4。由表可知，5种化合物的平均回收率在89.0%～107.0%之间，相对标准偏差(RSD)在0.30%～5.19%之间，表明建立的分析方法具有良好的准确度和精密度，可以满足实际样品的测定要求。

表3 对照组大鼠尿样加标回收率及相对标准偏差(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of the mouse urine sample in the control group(n=5)

表4 模型组大鼠尿样加标回收率及相对标准偏差(n=5)Table 4 Recoveries and RSDs of the mouse urine sample in the model group(n=5)

2.5 样品的测定

应用所建立的分析方法，对10只对照组大鼠和10只膀胱癌模型组大鼠的尿样进行了分析，结果如表5所示。由表可知，在对照组大鼠尿样中黄蝶呤、异黄蝶呤的含量在45.0～265.0 ng/mL之间，酪氨酸和色氨酸含量在13.4～3731.1 ng/mL之间；在膀胱癌模型组大鼠尿样中黄蝶呤和异黄蝶呤的含量在45.7～387.2 ng/mL之间，色氨酸和酪氨酸含量在7.6～3648.6 ng/mL之间；在两组样品中均未检出蝶呤-6-羧酸。

表5 尿样分析结果(n=3)Table 5 The analytical results of mouse urines samples(n=3)

3 结论

建立了高效液相色谱-串联质谱法同时检测大鼠尿液中的黄蝶呤、异黄蝶呤、蝶呤-6-羧酸、酪氨酸和色氨酸的分析方法，优化了色谱及质谱条件。实验结果表明，所测5种物质的线性良好(R>0.9991)，检出限在0.9～2.2 ng/mL之间，回收率在89.0%～107.0% 之间，相对偏差小于 5.19% 。该方法简单、快速、准确，灵敏度高，为进一步研究该5种物质与肿瘤发生与发展的相关性提供参考。