不同生物状态白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附能力及ALS mRNA表达

张辉等

[摘要] 目的 观察不同生物状态白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附能力及ALS mRNA表达，以期揭示口腔白色念球菌感染机制。 方法 将白色念珠菌3683、SC5314、3630与来源于50名健康志愿者的口腔上皮细胞混合培养，采用革兰阳性染色观察白色念珠菌的黏附能力，采用荧光定量RT-PCR法检测白色念珠菌3683、SC5314、3630中ALS2及ALS3 mRNA表达情况。采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析。 结果 黏附实验结果显示，3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮细胞，且菌株3683黏附数量明显多于菌株SC5314和菌株3630，统计学比较显示，差异有统计学意义（P < 0.05），而菌株SC5314和菌株3630黏附数量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。荧光定量RT-PCR结果显示，白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能检测到ALS2及ALS3 mRNA表达，其中，菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表达水平均高于菌株SC5314和菌株3630，统计学比较显示，差异有统计学意义（P < 0.05）；菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表达水平均高于菌株SC5314，但两者比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 不同生物状态白色念珠菌的口腔上皮细胞黏附能力不同，菌株黏附能力的强弱可能与其ALS2及ALS3基因情况表达相关。

[关键词] 白色念珠菌；口腔上皮细胞；黏附能力；基因表达

[中图分类号] R781 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（b）-0016-04

白色念珠菌为条件致病菌，长居于人体口腔、皮肤、胃肠道等部位，在维持机体生态平衡方面发挥重要作用。近年来由于免疫抑制剂、抗生素等的广泛使用，及糖尿病、艾滋病等发病率的逐年增加，导致患者机体免疫力低下，菌群失衡，使得白色念球菌大量繁殖，口腔白色念球菌感染率增加。白色念球菌的致病力与其黏附性有关[1-2]。研究显示，在小鼠感染模型中，口腔感染念球菌分离株3683、皮肤感染念球菌分离株3630及系统感染血液念球菌分离株SC5314致病能力差异较大，各菌株的黏膜黏附力不同可能是影响其致病能力的原因之一[3]。ALS基因家族主要编码白色念珠菌细胞壁表面的糖蛋白，与白色念珠菌和宿主间的黏附性密切相关。有研究证实，白色念球菌ALS基因在生物膜中的表达升高[4-5]。本研究刮取人口腔上皮细胞，并与白色念珠菌3683、SC5314、3630混合培养，检测不同生物状态白色念珠菌对口腔上皮细胞黏附能力及ALS mRNA表达情况，以期观察不同白色念珠菌致病力的差异，探讨其感染作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

白色念珠菌3683、SC5314、3630购自于ATCC；人口腔上皮细胞来源于50名健康志愿者。

1.2 试剂与仪器

沙堡液体培养基、RPMI 1640培养基及胎牛血清均购自美国Gibco公司；青霉素、链霉素及胰蛋白酶均购自美国Sigma公司；EDTA及细胞计数板购自上海碧云天生物技术有限公司；Trizol购自美国Invitrogenin公司；荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；引物购自上海生工；摇床购自德国UniEquip公司；ABI 3900台式高通量DNA合成仪、ABI 9700 PCR仪及ABI 7500全自动荧光定量均购自美国ABI公司。

1.3 白色念珠菌培养

将白色念珠菌3683、SC5314、3630接种于20 mL沙堡液体培养基中，于摇床培养18 h（37℃，200 r/min）。收集细菌，PBS洗2次，调整菌密度为1×107个/mL。

1.4 人口腔上皮细胞获取及培养

以细胞刮棒刮取来自浙江省温岭市第一人民医院的50名健康志愿者口腔上皮细胞，PBS洗两次，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，调整细胞密度为1×107个/mL。

1.5 黏附能力检测

将口腔上皮细胞与白色念珠菌3683、SC5314、3630以1∶100比例混合置于6孔板内，在摇床中孵育1 h（37℃，100 r/min）。行革兰阳性染色，显微镜下随机选择50个口腔上皮细胞，计数每个口腔上皮细胞上黏附的白色念珠菌数。实验重复3次。黏附能力计算为念球菌数/口腔上皮细胞数。

1.6 荧光定量RT-PCR

1.6.1 白色念珠菌

白色念珠菌培养同“1.3”项下，PBS洗3次，调整菌密度为2×106个/mL。

1.6.2 口腔上皮细胞

细胞获取同“1.4”项下，调整细胞密度为2×105个/孔接种于6孔板。

1.6.3 共培养及观察

将口腔上皮细胞与白色念珠菌3683、SC5314、3630分别以1∶10比例混合，RPMI 1640培养基培养，接种于6孔板，每孔1.5 mL，培养6 h，光学显微镜观察后，收集细胞，离心，置于-80℃冰箱保存。

1.6.4. 引物设计

ALS2：上游引物：5'-CCA AGT ATT AAC AAA GTT TCA ATC ACT TAT-3'，下游引物：3'-TCT CAA TCT TAA ATT GAA CGG CTT-5'，引物长度为366 bp。

ALS3：上游引物：5'-CCA CTT CAC AAT CCC CAT C-3'，下游引物：3'-CAG CAG TAG TAG TAA CAG TAG TAG TTT CAT C-5'，引物长度为342 bp。

GAPDH：上游引物：5'-TTG ACG GTC CAT CCC ACA A-3'，下游引物：3'-GGA ATA ACC TTA CCA ACG GCT TT-5'，引物长度为103 bp。

1.6.5 总RNA提取

用预冷的DEPC水1 mL清洗白色念珠菌，置于1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，静置5 min；加入0.2 mL氯仿，盖紧EP管，上下倾倒15 s，室温静置2～3 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清；加入0.5 mL异丙醇，-20℃放置1 h，4℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清；75%乙醇洗2次，4℃ 12000 r/min离心5 min，弃上清，吸取残存乙醇；无菌台干燥5～10 min，加DEPC水溶解，-80℃保存备用。

1.6.6 RNA纯度检测

应用紫外分光光度计检测RNA纯度，分别测定260 nm和280 nm波长下RNA的吸光度，计算A260/A280，若比值在1.8～2.0之间则提示RNA质量较好。

1.6.7 逆转录反应

反应体系为5×逆转录buffer 2 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL、dNTP 2 μL、RNase free dH2O 7.5 μL、OligodT 1 μL、Mgcl2 4 μL、AMV反转录酶 1 μL、RNA模板2 μL，反转录体系共计20 μL；混匀后置于PCR仪中，反应条件为：42℃ 1 h，99℃ 5 min；得到cDNA模板，置于-20℃保存。

1.6.8 荧光定量PCR

1.6.8.1 标准品制备 阳性标准品：预实验PCR扩增阳性产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外光下切割目的条带。采用回收试剂盒回收纯化。利用A260测得值和片段长度计算其浓度，作为阳性标准品。阴性标准品：采用灭菌双蒸水。

1.6.8.2 反应体系 5×SYBR Green Ⅰ PCR buffer 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dNTPs 1 μL，Taq酶1 μL，cDNA或阳性标准品1 μL，ddH2O 35 μL，反应体系共计50 μL。

1.6.8.3 反应条件 95℃ 3 min，95℃ 30 s，50℃ 45 s，共行42个循环。

1.6.8.4 数据测定 反应结束后，电脑分析结果，RNA表达=目的基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数。

1.7 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附能力

白色念珠菌3683、SC5314、3630与口腔上皮细胞共培养1 h后，革兰染色结果显示，3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮细胞，且菌株3683黏附数量（15.74±0.83）明显多于菌株SC5314（13.04±0.62）和菌株3630（13.11±0.57），差异有统计学意义（P < 0.05），而菌株SC5314和菌株3630黏附数量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 ALS2及ALS3 mRNA表达情况

念珠菌口腔与上皮细胞混合培养6 h，显微镜下观察显示口腔上皮细胞形态完整，周围黏附有白色念球菌，部分细胞已破裂为细胞碎片。基因检测结果显示，混合培养6 h后，白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能检测到ALS2及ALS3 mRNA表达，其中，菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表达率均高于菌株SC5314和菌株3630，统计学比较显示，差异有统计学意义（P < 0.05）；菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表达水平均高于菌株SC5314，但两者比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

3 讨论

白色念球菌是人体重要的机会致病菌，调查表明，近年白色念球菌的检出率逐年升高，其导致的医院感染排在第4位，且死亡率高达50%左右[6-7]。研究已经证实，黏附性为白色念球菌的致病机制之一[8]。过往白色念球菌对口腔上皮细胞的黏附性研究较多，但不同生物状态白色念珠菌黏附性的差异鲜有报道。本研究观察白色念珠菌3683、SC5314、3630对口腔上皮细胞的黏附能力，对治疗选择的临床指导意义重大。

本研究黏附实验是将白色念珠菌与口腔上皮细胞混合培养，观察一定时间后每个口腔上皮细胞黏附白色念珠菌数，该方法可直观证明菌株的黏附力，且操作简单[9]。本研究黏附实验结果显示，3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮细胞，且菌株3683黏附数量明显多于菌株SC5314和菌株3630，统计学比较显示，差异有统计学意义（P < 0.05），而菌株SC5314和菌株3630黏附数量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。提示白色念珠菌株3683的黏附力最强，其对口腔的致病力最强。导致不同生物状态白色念珠菌对口腔上皮细胞黏附能力差异的原因有待进一步分析。Zhao等[10]研究证实，野生型白色念球菌株（CA112）、剔除ALS3基因的白色念球菌株（als3/als31843）及剔除了ALS1基因的白色念球菌株（als1/als11467）对颊上皮细胞和血管内皮包被的细胞培养板的黏附作用不同，其中，菌株als3/als31843对颊上皮细胞和血管内皮细胞的黏附数明显较低，而菌株als1/als11467仅对血管内皮细胞的黏附能力较低。该结果提示了ALS家族基因功能的差异性及ALS3基因可能参与了白色念珠菌的黏附作用机制。

研究发现，ALS家族各基因的功能不同[11-12]。一项对阴道念球菌感染的研究发现，虽然在感染过程中ALS家族各基因均检出，但ALS3基因的检出率最高[13]。小鼠口腔念球菌感染模型初期检测显示，ALS1～4均可检出，提示其在念球菌感染初期已表达[14-15]。本研究结果显示，念珠菌口腔与上皮细胞混合培养6 h，白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能检测到ALS2及ALS3 mRNA表达，其中，菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表达率均高于菌株SC5314和菌株3630，差异有统计学意义（P < 0.05）；菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表达率均高于菌株SC5314，但两者比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。结合本研究黏附实验结果可见，白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附能力与菌株中ALS2及ALS3基因的表达强弱有关，其中黏附能力强的菌株3683其ALS2及ALS3基因表达水平高。提示ALS2及ALS3基因高表达可能为口腔白色念球菌感染致病机制之一。