盐芥CAS基因的生物信息学分析及在盐胁迫下的表达

余璐璐 +曹中权 刘龙山 范　崎 黄格格 徐飞

摘要：盐芥（Thellungiella salsuginea）是一种新型的模式植物，具耐盐特性，但盐芥的抗盐机理仍不清楚。本研究对盐芥氰丙氨酸合酶（cyanoalanine synthase，CAS）基因进行了生物信息学分析，并检测了盐胁迫条件下CAS基因的表达变化。生物信息学分析表明，编码盐芥CAS合酶的基因含有9个外显子和8个内含子，CAS合酶偏酸性，主要定位于细胞质中起作用。启动子分析表明，盐芥CAS基因启动子上有多个盐胁迫响应元件。进一步的盐胁迫试验表明，盐芥植株在200 mmol/L NaCl胁迫条件下表现出较强的抗性，CAS基因受胁迫诱导上升。盐胁迫处理后9 h，CAS基因表达高出对照组材料2倍，氰化氢（HCN）含量被降低到较低水平。这些结果表明，CAS基因在盐芥胁迫应答反应中起重要作用。

关键词：盐芥；氰丙氨酸合酶；盐胁迫；基因分析；基因表达；生物信息学

中图分类号：Q945.78 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）07-0025-05

盐芥（Thellungiella salsuginea）是一种有花的盐生植物，与双子叶植物研究中所常用的模式植物拟南芥亲缘关系较近[1-2]。盐芥具有对高盐、干旱和低温等非生物胁迫极高的耐受能力，使得盐芥成为研究植物非生物逆境胁迫机理的理想材料[3-5]。据统计，全球拥有大面积盐渍地，这些土地未能被完全开发和利用[6]。我国盐渍土面积约1亿hm2，高盐环境严重地影响了植物的生长和发育，是造成作物减产的主要原因之一[6]。随着世界范围内可耕地日趋减少以及盐碱、干旱等极端气候状况的日趋严重，研究植物耐盐胁迫的分子机制，寻找有效改良植物耐盐性的方法，已经引起人们广泛关注，并已成为植物分子生物学的研究热点[7-8]。诸多研究表明，盐胁迫等逆境因子会诱导乙烯反应[9-10]，乙烯反应的增强有助于植物减轻胁迫造成的伤害；所以，长期以来乙烯也被赋予“胁迫乙烯”之称。众所周知，乙烯的生物合成经蛋氨酸，在三磷酸腺苷（ATP）参与下，转变为S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），SAM 在ACC合成酶（ACC synthase，ACS）的作用下转化为1-氨基环丙烷1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carbox-ylic acid，ACC）和甲硫腺苷（5′-deoxy-5′ methylthioadenosine，MTA），ACC在ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）催化下产生乙烯[9]。值得注意的是，植物在产生乙烯的同时，会产生等量的氰化氢（hydrogen cyanide，HCN）[11]。HCN可抑制线粒体呼吸链中的细胞色素C氧化酶的活性，因而HCN对于生物体来说有很强毒性[11]。但是，植物具有产HCN并耐HCN的特性。一方面是因为植物体内存在一条由交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）介导的抗氰呼吸途径（cyanide-resistance respiration pathway），可减轻HCN对呼吸链的抑制作用[12]。另一方面，HCN会诱导芥氰丙氨酸合酶（cyanoalanine synthase，CAS）的活性，从而将HCN降低到安全浓度范围内[13]。鉴于乙烯在盐胁迫响应中的重要作用，及CAS合酶与乙烯的密切关系，本研究以盐芥植株为材料，对CAS基因进行生物信息学分析，并检测盐胁迫条件下盐芥CAS基因的表达量，以期为进一步阐明盐芥的耐盐机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 盐芥CAS基因生物信息学分析

盐芥CAS基因结构利用在线分析工具Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds1. cbi.pku.edu.cn/index.php）进行分析。氨基酸序列分析及同源进化树构建分别利用Vector NTI 11.5和MEGA 5.2软件进行。CAS基因亚细胞定位和蛋白成员理化性质分别使用WolfPSORT （http：//psort.hgc.jp/）和ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）进行预测分析。基因启动子响应元件进行在线分析（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）。

1.2 盐胁迫条件下盐芥CAS基因的表达分析

1.2.1 材料 盐芥种子来源于四川大学生命科学学院林宏辉教授实验室。盐芥种子春化后播种在含营养土和蛭石（1 ∶1）的培养基质上，同时施以1/2Hoagland营养液，培养 40 d 后幼苗用于试验。

1.2.2 盐胁迫处理 取6株长势一样的盐芥植株放置在平皿中，分为A、B 2组，然后用1/2Hoagland营养液适应培养 48 h。A组用200 mmol/L NaCl胁迫处理，B组为对照组。实时记录2组幼苗的生长情况。

1.2.3 盐芥总RNA的提取及基因表达分析 盐芥总RNA的提取采用Trizol（Invitrogen公司）试剂。总RNA逆转录为cDNA（TaKaRa公司试剂盒）后，荧光定量检测CAS基因表达量（引物设计如表1所示）。荧光定量PCR扩增使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒，每个循环扩增的目的基因片段通过SYBR-green Ⅰ荧光来检测，CT值用于检测目标基因的起始拷贝数，目标基因的相对含量通过相对CT值来表示，每组试验重复3次。Actin基因作为内参基因[14]。

1.2.4 氧化损伤检测分析 盐胁迫处理后，检测H2O2、丙二醛、电导率及失水率的变化情况。H2O2含量的测定参照 Velikova 等的方法[15]。丙二醛（MDA）含量、电解质渗漏和叶片失水率参照Xu等的方法[16]测定。

1.2.5 叶绿素含量检测 叶绿素含量的测定参照Kichtenchaler等的方法[17]：称取0.5 g叶片，用80%丙酮和少许 CaCO3 快速研磨成匀浆，然后用80%丙酮定容至20 mL；3 000 r/min 离心10 min，取上清液测定在470、646、663 nm处的吸光度（D）。

1.2.6 氰化氢含量检测 氰化氢（HCN）含量检测采用便携式气体检测器（GT901-HCN）：植物材料在2 000 mL透明容器中密闭处理2 h后，用气体检测器检测浓度。

2 结果和分析

2.1 盐芥CAS基因的生物信息学分析

2.1.1 盐芥CAS基因结构分析 利用在线分析工具Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds1. cbi.pku.edu.cn/index.php）对盐芥CAS基因结构进行分析，结果表明CAS基因有9个外显子和8个内含子（图1）。

2.1.2 盐芥CAS蛋白同源比对及进化树构建 从NCBI找到20个已知CAS蛋白序列的物种，并与盐芥CAS蛋白序列进行同源比对分析，利用MEGA5.2软件构建系统进化树。从图2可以看出，盐芥CAS蛋白序列与芜菁、亚麻荠、拟南芥和烟草的CAS蛋白序列同源性较高，亲缘关系较近，进化处于同一分支。

2.1.3 盐芥CAS蛋白的亚细胞定位及理化性质分析 盐芥CAS蛋白亚细胞定位使用WolfPSORT（http：//psort.hgc.jp/）进行预测，结果如图3所示：盐芥CAS蛋白主要定位于细胞质（预测比例达60.9%），其次是定位于线粒体和细胞核（预测比例均为13.0%），定位于过氧化物酶体和质膜的可能性较低，预测比例分别为8.7%和4.3%。使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对盐芥CAS蛋白进行理化性质分析，结果如表2所示，盐芥CAS蛋白氨基酸长度为323个，分子量为34 364.8 u。从理论等电点数据来看，CAS蛋白偏酸性（pI=5.47）。此外，蛋白不稳定性分析显示，盐芥CAS蛋白的不稳定指数为26.54，未超过临界值（大于40被认为不稳定），表明CAS蛋白稳定性较好。另外，从表2所显示的平均亲水性来看，CAS的亲水性值为0.066，表明其是疏水性蛋白，不过数值并不太高，推测其应是微溶于水。

2.1.4 盐芥CAS基因的启动子分析 利用NCBI在线数据库找到CAS基因的基因编码区上游序列，共计2 032 bp；利用日本PLACE在线分析系统对获得的启动子序列进行分析，结果表明，盐芥CAS基因启动子具有大量的逆境胁迫响应相关的元件，包括W box、AGMOTIFNTMYB2、MYB1AT、TC rich元件等（图4）。

2.2 盐芥CAS基因在盐胁迫响应过程中的变化

2.2.1 盐胁迫对盐芥生长的影响 在200 mmol/L NaCl胁迫处理12 h后，盐芥植株叶片开始卷曲，表现出明显的失水现象和一定的氧化损伤；但是，盐胁迫处理对盐芥叶绿素的合成影响较小，盐芥在胁迫处理条件下生长3 d，仍呈绿色状态，失水情况未进一步发生（图5），表明盐芥具有较强的耐盐性。

2.2.2 盐胁迫对盐芥CAS基因表达的影响 研究表明，盐胁迫处理能明显诱导CAS基因的表达（图6）。与对照组相比，200 mmol/L NaCl盐胁迫处理盐芥幼苗后，CAS基因的表达明显上升，尤其是在胁迫处理9 h后，CAS基因的表达量上升近2倍。由此推测，CAS基因参与了盐芥盐胁迫应答反应。

3 讨论

与拟南芥相比，盐芥耐贫瘠性强，生命力旺盛，根系强大；但到目前为止，盐芥的抗逆机理仍不是很清楚。本试验对盐芥CAS基因进行了生物信息学分析，并研究了盐芥CAS基因在盐胁迫条件下的表达变化，以期为进一步揭示盐芥对逆境胁迫的耐受机制奠定基础。通过生物信息学研究发现，盐芥CAS基因有9个外显子和8个内含子。启动子分析结果表明，CAS基因启动子上有较多与逆境胁迫响应相关的元件，包括 W-box、MYB响应元件等。由此推测，CAS基因可能参与了盐芥盐胁迫应答。CAS蛋白氨基酸长度为323个，分子量为34 364.8 u，蛋白偏酸性（pI=5.47），微溶于水。从蛋白作用部位来看，CAS蛋白主要作用部位为细胞质，其次为线粒体。鉴于CAS合酶是代谢植物HCN的关键酶，而HCN主要伴随乙烯的合成产生，我们推测CAS合酶与降低盐胁迫诱导乙烯合成过程中的HCN含量，及减轻HCN对线粒体呼吸

链的抑制作用有关。

试验结果表明，与对照组相比，盐芥在200 mmol/L NaCl胁迫条件下叶片表现出一定程度的损伤，H2O2、MDA和电解质渗漏都有明显上升，但整体生长状况良好，叶绿素含量仍维持在一个较高水平，表明盐芥具有较强的耐盐性。据报道，盐芥可以在500 mmol/L NaCl的高盐生境下完成生活史，耐盐能力远强于只能耐受100 mmol/L NaCl的拟南芥[18]。另有研究表明，盐芥对高盐的耐受性可能与盐芥具有苗期生长较旺、根系发达、叶肉致密等优点有关[14，19]。本研究发现，盐胁迫处理后，CAS基因的转录明显上升。盐胁迫处理9 h后，CAS基因的转录水平最高，高出对照组近2倍。García等研究表明，CAS合酶表达的上升有助于减少逆境胁迫引起的活性氧（ROS）累积，从而减轻氧化损伤，维持植物的正常代谢生长[20]。因此，本研究中CAS基因的诱导表达应该也是盐芥对盐胁迫高度适应的原因之一。

从HCN含量变化检测结果可以看出，在盐胁迫3 h后，HCN含量开始上升，在9 h后达到峰值，随后开始下降，并在48 h后接近处理前的水平。这些结果表明，CAS合酶受HCN的诱导，盐胁迫条件下CAS合酶表达量上升有助于减少细胞内HCN的积累，减轻HCN对细胞尤其是线粒体的损伤。但同时也可看出，HCN在盐胁迫处理3 d后，也没有完全恢复到处理前的水平，表明低浓度的HCN在盐芥盐胁迫应答过程中具有一定作用。Xu等研究表明，低浓度的HCN（20 μmol/L）有助于提高黄瓜幼苗抵御盐渍、干旱和冷害胁迫[12]。Seo等研究发现氰化物处理能提高水稻抵御真菌的侵害[21]。Liao等研究报道外施KCN能增强番茄对TMV的抗性[22]。此外，HCN被证实在种子萌发中起正调控的作用，还能作为氮源被植物吸收利用[23-24]。因此，进一步研究CAS合酶与HCN间的动态关系，将有助于揭示植物的耐盐机制。

总之，本研究表明盐芥具有较强的耐盐性，CAS基因在盐芥盐胁迫适应过程中受明显的诱导表达，CAS合酶通过有效降低HCN的浓度，保护线粒体呼吸链的正常运转。同时，低浓度的HCN可能在盐芥逆境胁迫应答过程中扮演着重要角色，但具体机制还需要更多的研究来证实。

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