膀胱癌干细胞的研究进展

张海洋 施敬瑶 李长福

1.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院泌尿外科，黑龙江哈尔滨 150040；2.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院肿瘤内一科，黑龙江哈尔滨 150040

膀胱癌手术治疗后易复发， 目前的研究认为是由于膀胱癌干细胞的存在。 肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC） 是指存在于肿瘤组织及肿瘤细胞系中具有自我更新能力、 多向分化潜能并能产生异质性肿瘤细胞的细胞群体。 肿瘤干细胞理论认为，肿瘤干细胞表面存在能排出化疗药物的分子泵， 从而对化疗药物反应不敏感，与肿瘤的远处器官转移、耐药性的产生和复发均有密切关系。 只要肿瘤组织中存在少量的肿瘤干细胞，肿瘤就不可能被治愈，仍会复发。在泌尿生殖道肿瘤中， 目前仅有前列腺癌肿瘤干细胞得到成功分离和鉴定[1-2]，膀胱癌干细胞的研究也有一定的进展。

1 膀胱癌干细胞的生物学特性

1.1 膀胱癌异质性

早在1970 年开始， 国外研究人员就已经发现膀胱癌肿瘤组织存在异质性，膀胱癌肿瘤组织中存在一小部分细胞能够在体外形成克隆，而其他绝大多数肿瘤细胞不具备这样的特性。

1.2 极强的致瘤能力

虽然肿瘤干细胞的含量极低，但其具有极强的致瘤能力，易形成克隆或动物体内成瘤，具有独特的生物学特性。

1.3 自我更新并可多向分化的能力

国外学者研究将乳腺癌干细胞移植到裸鼠体内，可以生成乳腺癌全部的肿瘤组织病理类型，这说明乳腺癌肿瘤干细胞具有自我更新与多向分化的能力[3]。Gaisa 等[4]利用双色酶组织化学法证实尿路上皮中细胞色素氧化酶缺陷的区域存在相同的体细胞线粒体DNA 变异，表明这些区域是一个克隆单位，包含尿路上皮中所有分化阶段的细胞，此项研究证实在尿路组织中存在尿路上皮干细胞。

1.4 自我保护能力

细胞周期实验证实，肿瘤干细胞通常处于静止状态，更多的肿瘤干细胞处于细胞周期的G0/G1期，而处于S 期的细胞较少，并且具有较高的DNA 修复能力，表达高水平的抗凋亡蛋白， 而且过高表达ABCG2 蛋白，其能将抗肿瘤药物和细胞毒素泵出细胞外，从而逃避化疗药物的杀伤作用[5-6]。

2 膀胱癌干细胞的分离筛选

早在20 世纪70 年代，急性髓性白血病[7]的肿瘤干细胞是最先被发现及分离出来的，陆续地又有9 种人类肿瘤干细胞被成功分离鉴定，但至今仍有大部分肿瘤干细胞还未被成功分离鉴定，其中包括膀胱癌肿瘤干细胞。 国内有学者证实了膀胱癌初始细胞EMACD44v6+细胞具有膀胱癌干细胞的特性，间接地证明存在膀胱癌干细胞，但其仍没有成功得到分离鉴定[8]。但研究者们从未放弃对膀胱癌干细胞的分离及鉴定的探索，并已取得了一定进展。

通常分离肿瘤干细胞的方法有三种。第一种是利用干细胞表面标志物，应用流式细胞仪和免疫磁珠分选法进行肿瘤干细胞的筛选，这种肿瘤干细胞分离方法也是最常用的，然而膀胱尿路上皮癌没有特定的干细胞表面标志物[9]。Chan 等[10]利用Lineage-CD44+CK5+CK20-标志物从原代膀胱癌细胞中成功分离出膀胱癌启动细胞（bladder cancer-initiating cell），在小鼠体内形成移植瘤仅需要1×102～1×103个CD44+肿瘤细胞，并且能促进膀胱癌的进展。Yang 等[8]研究利用干细胞表面标志物发现， 膀胱癌组织中存在的CD44v6+EMA-MUC-细胞可能是膀胱癌干细胞。Tatokoro 等[11]也通过实验证实， 膀胱移行细胞癌5637 细胞株中的CD44+细胞亚群具有膀胱癌启动细胞的相关特征，对化疗药物顺铂产生更强的耐药抵抗力，并且表达更高的Akt 和ERK 分子致瘤性信号通路， 使用热休克蛋白90（HSP90）信号通路抑制剂可以显著提高膀胱癌启动细胞对化疗药物顺铂的敏感性。 学者Su 等[12]利用乙醛脱氢酶1（ALDH-1）从膀胱移行细胞癌组织中分离膀胱癌干细胞， 发现ALDH-1 的表达与膀胱癌患者特异性生存率和总生存率呈负相关。 Atlasi 等[13]在2007 年首次报道了在膀胱癌细胞中存在高表达OCT-4 干细胞标志物。 Xu 等[14]研究证实，膀胱癌组织中有少量能用全能干细胞标志物OCT-4 成功标记的OCT-4 阳性膀胱肿瘤细胞， 这些OCT-4 阳性肿瘤细胞被认为可能是膀胱癌干细胞。 但是，这个全能干细胞表面标志物OCT-4 并不是膀胱癌干细胞所特有的。所以试图利用肿瘤干细胞表面标志物成功分离出膀胱癌干细胞的方法需要进一步探索研究。

第二种是利用无血清培养基（serum-free medium，SFM）即普通干细胞的培养基的方法分选膀胱癌干细胞，因胎牛血清中有促进干细胞分化的营养成分，为了避免肿瘤干细胞分化，采用无血清培养基分离肿瘤干细胞。 肿瘤干细胞易呈悬浮球或微球体生长，并且可以连续传代培养， 形成的肿瘤微球体与亲代肿瘤球具有相同的细胞生物学特性。 有研究者发现，利用无血清培养基培养脑神经胶质瘤的肿瘤干细胞时，可以筛选、扩增并形成癌细胞球或微球体[15-16]，但同时这种方法会有大量的非肿瘤干细胞混入， 致使分离出的肿瘤干细胞亚群纯度不高， 这也只能作为分离筛选肿瘤干细胞的辅助方法。曹正国等[17]从膀胱肿瘤组织中采用无血清悬浮培养法成功分离培养获得膀胱癌干细胞样细胞，其高表达PIWIL12 蛋白。 宁志丰等[18]也利用无血清悬浮培养从膀胱癌T24 细胞株中分离出微球体， 并验证这些微球体有肿瘤干细胞的特点。

最后一种则是利用流式细胞仪分离侧群细胞（SP）的方法。目前的研究认为，侧群细胞是具有一定干细胞特性的一类细胞亚群，能够有效地从细胞内泵出Hoechst 33342 染料而不被染色的一小群细胞， 普通正常细胞表面因没有相关转运蛋白而被染色，特别适用于没有特异性干细胞表面标志物的肿瘤干细胞筛选[19]。 Ning 等[20]在2009 年首次报道利用流式细胞术在3 种膀胱移行细胞癌细胞系EJ、UM-UC-3、T24 中筛选侧群细胞，最后仅在膀胱癌细胞株T24 中发现了34.7%的侧群细胞， 且这些筛选出的侧群细胞中的绝大数处于细胞周期的G0/G1期、 具有更强的生长增殖能力和克隆形成能力，对放疗及化疗均不敏感。但是，肿瘤干细胞理论认为，肿瘤干细胞在普通肿瘤细胞系中的比例小于10%，因此这种筛选侧群细胞的方法仍不合适于用来分离膀胱癌干细胞，但至少，这也能说明膀胱癌T24 细胞中可能含有膀胱癌干细胞，是研究膀胱癌干细胞较好的细胞模型。

虽然，目前利用以上三种实验方法都无法成功分离出膀胱癌干细胞。但上述研究成果为以后实验进行人膀胱癌干细胞样细胞的分离和鉴定提供了重要的理论基础和实验方法。 在2009 年Tan 等[21]率先利用化疗药物在小鼠荷瘤模型中分选出肝细胞癌肿瘤干细胞后，国内有学者也开始利用化疗药物丝裂霉素C从膀胱癌移行细胞癌T24 细胞株中筛选耐药细胞，验证发现， 剩余存在7.5%的耐药细胞可能是膀胱癌干细胞[22]。 Zhang 等[23]用高浓度化疗药物顺铂筛选出的耐药细胞被证实是膀胱癌干细胞样细胞。这也为进行化疗药物结合无血清培养基技术分选出膀胱癌干细胞样细胞提供了实验依据。

3 膀胱癌干细胞的治疗

肿瘤干细胞理论可以解释临床上应用化疗药物或和放射线治疗肿瘤细胞的效果不理想的原因。普通的肿瘤细胞具有很强的增殖能力，持续地进行细胞增殖，常规的化学药物治疗或和放射治疗能大量杀伤处于细胞周期增殖阶段的肿瘤细胞。但肿瘤干细胞具有较强的自我更新能力，且多数肿瘤干细胞处于细胞周期的静止期，其细胞表面具有分子泵相关蛋白，这些肿瘤干细胞表面的分子泵蛋白与正常干细胞一样拥有排出化疗药物的功能，导致对化疗药物不敏感。 所以肿瘤干细胞与正常干细胞都具有抵御化疗与放射治疗的能力[24]。 从而使肿瘤干细胞自身逃逸了化疗药物毒性和放射线的杀伤。 虽然如此，但研究人员没有放弃抗肿瘤干细胞药物的研发，针对肿瘤干细胞的化疗药物已经有了一定的发展。 Gupta 等[25]利用肿瘤干细胞成功筛选出抗乳腺癌的高效抗癌药， 研究发现，某些药物能够有选择性地杀伤乳腺癌干细胞，如盐霉素药物作用乳腺癌干细胞时，能导致乳腺癌干细胞某些基因表达缺失，从而起到杀伤作用。 Chan 等[10]研究发现，免疫球蛋白样跨膜整合素相关蛋白（IAP/CD47）几乎在所有的膀胱癌细胞中表达，且CD47 在膀胱癌干细胞表达显著增高。 使用单克隆抗体阻断CD47 信号通路可以在体外诱导巨噬细胞对膀胱癌细胞的吞噬作用。由此，CD47 可能成为膀胱癌干细胞的一个潜在的治疗靶点。目前肿瘤干细胞靶向治疗的研究主要集中在表面标志物和相关信号传导途径的小分子抑制物[26]，而靶向治疗联合传统治疗对肿瘤干细胞将可能会有更好的疗效。

4 结语与展望

膀胱癌具有手术治疗后容易复发的特点，虽然术后辅助膀胱灌注化疗可以在一定程度上降低复发可能性，但临床治疗中仍有较高的复发概率。 恶性肿瘤细胞生长、转移和复发的特点与干细胞的基本特性十分相似。 应寻找更有效的方法分离膀胱癌干细胞，研发抑制膀胱癌干细胞自我更新的药物，开展针对膀胱癌干细胞的治疗。 因此，寻找膀胱癌干细胞及其信号途径中新的治疗靶点将成为今后肿瘤研究的重点，更能为泌尿生殖系统肿瘤患者带来治疗的新曙光以及为临床肿瘤治疗提供新的方向和视觉角度。

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