急性呼吸窘迫综合征肺泡上皮屏障损伤的研究进展

赵 维 李玉英

第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037

肺泡上皮屏障和肺微血管内皮屏障被认为是肺部的两大生理屏障。 急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）时，两大屏障均有不同程度的受损，导致肺微血管通透性增高，肺泡腔渗出富含蛋白质的液体， 进而导致肺水肿及透明膜形成。近年来研究发现肺泡上皮细胞屏障比肺微血管内皮细胞屏障在抵抗ARDS 发生的过程中作用更强，本文将对ARDS 时肺泡上皮屏障 （alveolar epithelial barrier，AEB）损伤的研究进展作简要综述。

1 肺泡表面活性物质

肺泡上皮细胞顶端覆盖一层稀薄的液体膜，称为肺泡上皮表面液体，有利于维护肺泡表面张力，气体交换和宿主防御功能，其主要成分为肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）。

1.1 PS 的主要成分及功能

PS 是由肺泡Ⅱ型细胞合成的脂类（90%）和蛋白质（5%～10%）的混合物，其主要脂质成分包括磷脂（80%）、胆固醇（10%），其余磷脂还有磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、溶血磷脂。 其中的二棕榈酰磷脂酰胆碱（dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC）是最重要的活性成分，并且占了总磷脂的50%或更多。

表面活性蛋白（surfactant protein，SP）目前发现有四种：SP-B、SP-C 是疏水性蛋白， 吸附在气-液界面，负责稳定磷脂膜，降低表面张力；SP-A、SP-D 是亲水性蛋白，作为主要的宿主防御成分，结合病原微生物，直接造成微生物膜的损伤，并且增强巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬和杀伤能力。 近来发现，SP-B、SP-C 以及某些脂质成分也具有与SP-A、SP-D 相似的免疫调节特性。 其中，SP-B 是降低表面张力的最关键的蛋白[1]。

1.2 ARDS 时肺表面活性物质的损伤

PS 作为AEB 的第一道防线，ARDS 由于各种病理因素，PS 的含量与成分发生改变， 活性受到抑制，进而使肺受到不同程度的损害， 可能有以下几种方式：

1.2.1 血浆成分对PS 的抑制 ARDS 由于内皮和上皮细胞损伤，血浆中的血浆蛋白、血红细胞、纤维蛋白和纤维蛋白降解产物渗漏入肺泡腔，与表面活性剂相关蛋白竞争吸附作用，阻碍表面活性剂膜的形成。 大量的临床研究表明外源性PS 的补充即使可改善ARDS患者的氧合， 但对生存率的改善仍没有确切证据，血浆成分的这一抑制作用也许是其疗效不确定的影响因素之一。

1.2.2 活性氧引起的损伤 各种活性氧， 包括过氧化氢、超氧化物和氮氧化物在炎症细胞的活化下大量释放，引起脂质和蛋白质的氧化，导致PS 功能障碍。Zhu等[2]研究证实ARDS 患者肺水肿液和血浆中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度均增高，SP-A 也被硝化，PS 功能受损。

1.2.3 PS 磷脂成分的改变 Machado-Aranda 等[3]临床研究发现ARDS 患者支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中Ⅱ型分泌型磷脂酶A2（type Ⅱsecretory phospholipase A2，sPLA2-Ⅱ） 的活性增加，sPLA2Ⅱ可将表面活性剂磷脂分解为溶血磷脂酰胆碱（lyso-phosphatidylcholine，lyso-PC），lyso-PC 通 过 损害肺泡Ⅰ型细胞膜， 直接增加毛细血管通透性，而SP-A 可抑制sPLA2Ⅱ对PS 的降解。但ARDS 时，SPA 显著减少，这种抑制作用也显著减弱，lyso-PC 大量生成。 另外，ARDS 时PS 中棕榈酸比例明显降低，也增加了最小表面张力[4]。

1.2.4 表面活性物质合成的减少 ARDS 肺泡上皮细胞受损与PS 合成减少互为因果。不仅表现为PS 的直接损失， 也包括炎症因子导致的基因表达的降低。Greene 等[5]研究发现在ARDS 发病前，SP-A、SP-B 就已发生表达的异常。 肺水肿液中更低的SP-D 和血浆中更高的SP-A 浓度，关系着ARDS 患者更严重的疾病程度和更差的临床预后，可作为对预后有价值的生化标志物[6]。

1.2.5 大小聚集体转换失调 PS 大聚集体是由层状体、管状髓鞘和大的多层囊泡组成，有高度的表面活性，而小聚集体中为单层囊泡，无表面活性。 ARDS中，随着小聚集体的增加， 大的表面活性剂聚集体减少，大小聚集体比例失调，严重抑制了PS 活性。 PS 大聚集体水平的降低与ARDS 患者较低的生存率有关[7]。

2 紧密连接

2.1 紧密连接的结构基础

紧密连接（tight junction，TJ）是AEB 的决定性结构。TJ 主要由紧密连接蛋白核心复合物构成。已知的TJ 的主要功能成分包括跨膜蛋白（claudins、occludin）和闭小环蛋白（ZO-1、ZO-2、ZO-3），闭小环蛋白连接着claudins 和肌动蛋白细胞骨架。 相邻细胞间的claudin 头对头的相互作用形成了细胞旁渗透性屏障的结构基础。

2.2 紧密连接的功能

TJ 的两个主要功能：一是形成极窄的细胞间粘连，以遮挡细胞外空间。 实验发现，水溶性溶质在肺泡上皮细胞之间的扩散要比通过肺毛细血管的细胞间连接慢得多。肺泡上皮对水溶性溶质的有效孔隙半径为0.5～0.9 nm，也远小于毛细血管内皮细胞的6.5～7.5 nm[8]。这些都证实了肺泡上皮细胞比肺毛细血管内皮细胞具有更强的TJ 屏障特性。 二是创建可调的分子选择性筛孔。 TJ 没有绝对的密封，在细胞外的连接部分包含着离散的离子选择性孔，发挥相对阴离子选择性和潜在的水运输功能。

2.3 ARDS 时紧密连接的受损

ARDS 时复杂而大量的炎症介质释放，启动了对紧密连接蛋白的膜定位和表达的扰乱，严重破坏了TJ的功能，AEB 受损：首先，ARDS 由于炎症刺激，或机械通气所致的细胞内钙离子的升高，促使蛋白激酶和蛋白磷酸酶对occludin 进行磷酸化或去磷酸化，导致TJ 降解或合成[9]。Liu 等[10]通过动物实验发现用蛋白激酶C （protein kinase C，PKC） 抑制剂预处理大鼠后，occludin 的表达增加， 从而减少或延缓了机械通气损伤。其次，在炎症细胞因子或内毒素的作用下，各种类型的细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、 上皮细胞合成并释放大量的NO 和诱导型一氧化氮合酶（iNOS），干扰紧密连接蛋白的表达和完整性[11]。 Han 等[12]在LPS 致肺损伤小鼠模型中，发现ZO-1、ZO-2、ZO-3 和occludin 表达均减少，且肺泡屏障功能的下降与肺组织中iNOS 表达上调和NF-κB的激活相关。 iNOS 抑制剂可改善TJ 蛋白表达的变化，也支持了iNOS 在TJ 的破坏上的重要作用。

另外，ARDS 中的促炎性反应导致内皮细胞受损，从而激活过度的促凝血过程，也是TJ 受损的重要因素之一。 Puig 等[13]体外实验提示，凝血酶导致更细长的ZO-1 聚集，并诱导ZO-1 膜蛋白水平含量提高。用活化蛋白C（activated protein C，APC）预处理后，可减弱ZO-1 发生的上述改变，降低凝血酶诱导的屏障完整性的破坏。 APC 雾化药也可减轻肺损伤。

3 钠水转运系统

钠通道ENaC、Na+-K+-ATP 酶和水通道蛋白（aquaporins，AQPs）共同组成肺泡上皮细胞的钠水转运系统，清除肺泡内过多液体，发挥AEB 的主要功能。

3.1 钠转运系统的基本构成及功能

钠的转运已被证实是跨上皮屏障主动吸收肺泡内液体的主要驱动力。 钠在肺泡腔中的主动转运，伴随着阴离子和水的被动转运。钠大部分是通过位于肺泡上皮细胞顶端膜的敏感ENaC 通道进入细胞内，而位于上皮细胞基底膜的Na+-K+-ATP 酶是唯一的主动排出钠的转运蛋白。 ENaC 由三个亚基（α、β 和γ）构成，对钠离子具有选择性。Na+-K+-ATP 酶由α 亚单位（α1和α2）和β 亚单位（β1）构成，α 亚基含有高能磷酸裂解位点， 结合Na+、K+和核苷酸，β 亚基负责酶在细胞膜上的插入和组装。两种钠转运蛋白在肺泡上皮Ⅰ型和Ⅱ型细胞上均有分布， 且肺泡Ⅰ型细胞对钠、钾的摄取能力均强于肺泡Ⅱ型细胞。钠转运蛋白对肺泡液体的清除有至关重要的作用。

3.2 ARDS 时钠转运系统的受损

肺泡上皮钠转运蛋白的受损，主要表现为从细胞膜转移到细胞内的内化增加以及合成的减少，破坏增多，主要有以下几种方式：

3.2.1 细胞因子对钠转运蛋白的影响 临床研究已提示ARDS 患者的BALF 中转化生长因子β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）水平增加，并且较低的TGF-β1与生存率的改善相关。Peters 等[14]研究发现增加的TGF-β1通过快速激活磷脂酶D1（phospholi pase D1，PLD1），磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶1α（phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase 1α，PIP5K1α），和NADPH 氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4），产生活性氧，驱动βENaC 的内化作用，减少其在细胞膜的表达。TGF-β 还能降低αENaC 基因表达，在转录水平上进行长期调节。 Fukuda 等[15]指出，肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α） 在肺水肿的病理过程中具有双重作用，既可引发急性炎症和肺水肿的形成，又可通过激活敏感ENaC 促进肺水肿的消退。 5-羟色胺（serotonin，5-HT）已被Goolaerts 等[16]报道可显著 抑 制 敏 感 的ENaC 活 性。 IL-1β 是ARDS 患 者BALF 中最具生物活性的细胞因子，Roux 等[17]已证实IL-1 是通过抑制αENaC 启动子的活性影响αENaC的转录，导致αENaC 合成的减少。白三烯（leukotriene，LTs） 作为强效的促炎性脂质介质，Sloniewsky 等[18]指出ARDS 中增加的LTD4 通过CysLT2 受体，对Na+-K+-ATP 酶α1亚基的分布进行再分配，上调其在肺泡上皮细胞基底膜的表达，促进了Na+-K+-ATP 酶的活性及肺液清除。 然而Fink 等[19]另外的实验指出，LTD4 和LTE4 受体拮抗剂可改善ARDS 的肺水肿。LTD4 呈剂量依赖性增加肺微血管通透性。 这一矛盾的结果，可能取决于LTD4 的不同浓度，在相对高的浓度下肺微血管通透性显著增加，促进肺水肿，而在较低浓度时则以Na+-K+-ATP 酶活性的增高为主。

3.2.2 其他激素对钠转运蛋白的影响 Bastarache 等[20]研究表明，ARDS 肺水肿的女性患者比男性有更高的肺泡液体清除率 （alveolar fluid clearance，AFC）。 此外，17β-雌激素、 孕激素联合用药可通过增加ENaC表达和活性而增加AFC[21]。 Qi 等[22]后来的研究指出，17β-雌二醇对PI3K/AKT/SGK1 信号通路的调节可能是其具体机制，SGK1 再通过E3 泛素蛋白连接酶的磷酸化上调ENaC，抑制αENaC 的降解，增加αENaC在细胞膜的表达和活性。 ARDS 时血浆和肺组织中内源性AngⅡ水平应激性增加， 并通过AT1 受体下调ENaC 的表达，进而降低AFC[23]。

3.2.3 对钠转运蛋白的泛素化作用 Na+-K+-ATP 酶的下调主要是通过磷酸化-泛素化-识别-内吞-降解途径（PERED）。 ARDS 时，由于肺泡上皮细胞严重缺氧，线粒体产生活性氧增加，激活PKC，PKC 随后使Na+-K+-ATP 酶α1亚基的N-末端Ser18 残基磷酸化，导致相邻的赖氨酸泛素化， 这个过程又促进了适配器蛋白-2 对α1亚基的识别，继而发生内吞作用，最后泛素化的Na+-K+-ATP 酶通过溶酶体/蛋白酶体依赖性机制进行降解，导致Na+-K+-ATP 酶破坏增多[24]。

3.2.4 肺泡上皮细胞的死亡 各种直接的或间接的肺损伤因素都会导致肺泡上皮细胞的直接丧失或坏死，伴随两种钠转运蛋白数量的绝对减少及活性的丧失，且如果ARDS 损伤的因素不去除，肺泡上皮细胞就会持续死亡，对钠转运蛋白的下调也会一直持续。

3.3 水通道蛋白的分布及其功能

肺泡液体中水的吸收，除了通过钠离子主动转运形成的离子梯度被动吸收外，AQPs 也是其吸收的主要途径。AQPs 是一组对水特异通透的膜蛋白，其转运水能力是脂质双分子层的5～50 倍。 目前发现至少有4 种AQPs 在呼吸道表达，AQP1 分布在脏层、 壁层胸膜上皮下层的微血管内皮细胞及间皮细胞上，AQP3分布在大气道及鼻咽部上皮细胞的顶端膜，也表达于小气道上皮细胞，AQP4 在气管、支气管、鼻咽部纤毛柱状上皮的基底侧膜表达，AQP5 分布在肺泡Ⅰ型细胞的顶端膜，黏膜下腺体的腺泡上皮细胞。 而与肺泡液体清除相关的主要是AQP1、AQP4 和AQP5。

Ma 等[25]研究表明气腔-血管水的渗透性[airspacecapillary osmotic water permeability（P（f））]在AQP5、AQP1 缺失的小鼠中分别降为原来的1/10， 在AQP1/AQP5 双缺失的小鼠中降为原来的1/30～1/20，充分说明了AQPs 对水的高度渗透性。 然而， 即使AQP1/AQP5 双基因敲除小鼠P（f）已降低达30 倍，肺泡液体清除仍然不受影响[26]。 AQP4 基因缺失不影响水的渗透或肺泡液体清除率[27]。 这些都表明AQPs 对肺液的生理性清除并不是必需的， 可能与ENaC 和Na+-K+-ATP 酶以及细胞旁运输对水转运的代偿作用有关。

3.4 ARDS 时水通道蛋白的损伤

ARDS 时各种炎症因子导致AQPs 表达下调，如TNF-α 可通过激活TNFR1 和NF-κB， 降低AQP5 的表达[28]。Su 等[29]体外研究也表明，ARDS 时AQP1 表达减少，但耗尽AQP1 并不会影响肺水肿，肺血管通透性，或肺组织学的改变，ARDS 中下降的AQP1 可能并不会促进肺水肿的发生发展。 其原因也许在于ARDS时气血屏障受到严重破坏， 致细胞旁渗透性显著增加，甚至取代AQPs 成为主要的水渗透途径。然而She等[30]对小鼠诱导高原性肺水肿的实验中，AQP5 缺失小鼠表现出更高的肺泡毛细血管通透性及更严重的肺水肿。 Zhang 等[31]建立铜绿假单胞菌感染致肺损伤模型， 发现AQP5 的缺失也加剧细菌的血液传播，加重肺损伤。 这些又支持了AQP5 在ARDS 时AEB 功能中的重要作用，AQPs 对ARDS 肺水肿的发生发展仍具有争议。

AQP1 缺失的小鼠肿瘤血管生成显著减少，广泛扩散也受到抑制。 Saadoun 等[32]在体外内皮细胞中转染AQP1 或AQP4 后，均加速了细胞迁移和损伤修复。因此AQPs 也许对AEB 的损伤后修复有重要作用。

4 小结

AEB 具有抵抗外界损伤的能力，但在各种严重的致病因素作用下，AEB 受到直接或间接的破坏， 并且导致广泛的、无法控制的炎症细胞激活，并伴随大范围的、有害介质的释放，如细胞因子、蛋白水解酶，具有生物活性的脂质，与活性氧、激活的炎症细胞及介质，反过来又会加重对AEB 的进一步破坏，严重损害肺泡液体清除能力，造成肺水肿程度的加重，形成恶性循环。 因此有效的AEB 修复对于ARDS 患者的治疗是非常重要的， 这就要求我们首先应对ARDS 时AEB 损伤的细胞分子机制有更深入清晰的了解，才能指导治疗。

[1] Chroneos ZC，Sever-Chroneos Z，Shepherd VL. Pulmonary surfactant：an immunological perspective [J]. Cell Physiol Biochem，2010，25（1）：13-26.

[2] Zhu S，Ware LB，Geiser T，et al. Increased levels of nitrate and surfactant protein a nitration in the pulmonary edema fluid of patients with acute lung injury [J]. Am J Respir Crit Care Med，2001，163（1）：166-172.

[3] Machado-Aranda D，Wang Z，Yu B，et al. Increased phospholipase A2 and lyso-phosphatidylcholine levels are associated with surfactant dysfunction in lung contusion injury in mice [J]. Surgery，2013，153（1）：25-35.

[4] Schmidt R，Meier U，Yabut-Perez M，et al. Alteration of fatty acid profiles in different pulmonary surfactant phospholipids in acute respiratory distress syndrome and severe pneumonia [J]. Am J Respir Crit Care Med，2001，163（1）：95-100.

[5] Greene KE，Wright JR，Steinberg KP，et al. Serial changes in surfactant-associated proteins in lung and serum before and after onset of ARDS [J]. Am J Respir Crit Care Med，1999，160（6）：1843-1850.

[6] Cheng IW，Ware LB，Greene KE，et al. Prognostic value of surfactant proteins A and D in patients with acute lung injury [J]. Crit Care Med，2003，31（1）：20-27.

[7] Schmidt R，Markart P，Ruppert C，et al. Time-dependent changes in pulmonary surfactant function and composition in acute respiratory distress syndrome due to pneumonia or aspiration [J]. Respir Res，2007，8（8）：55.

[8] Taylo AE，Gaar KA. Estimation of equivalent pore radii of pulmonary capillary and alveolar membranes[J].Am J Physiol，1970，218（4）：1133-1140.

[9] Rao R. Occludin phosphorylation in regulation of epithelial tight junctions [J]. Ann N Y Acad Sci，2009，（1165）：62-68.

[10] Liu M，Gu C，Wang Y. Upregulation of the tight junction protein occludin：effects on ventilation-induced lung injury and mechanisms of action [J]. BMC Pulm Med，2014，14（3）：63-68.

[11] Asano K，Chee CB，Gaston B，et al. Constitutive and inducible nitric oxide synthase gene expression，regulation，and activity in human lung epithelial cells [J]. Proc Nat Acad Sci U S A，1994，91（21）：10089-10093.

[12] Han X，Fink MP，Uchiyama T，et al. Increased iNOS activity is essential for pulmonary epithelial tight junction dysfunction in endotoxemic mice [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，286（2）：L259-L267.

[13] Puig F，Fuster G，Adda M，et al. Barrier-protective effects of activated protein C in human alveolar epithelial cells [J]. PLoS One，2013，8（2）：65.

[14] Peters DM，Vadász I，Wujak L，et al. TGF-β directs trafficking of the epithelial sodium channel ENaC which has implications for ion and fluid transport in acute lung injury [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（3）：E374-E383.

[15] Fukuda N，Jayr C，Lazrak A，et al. Mechanisms of TNFalpha stimulation of amiloride-sensitive sodium transport across alveolar epithelium [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280（6）：L1258-L1265.

[16] Goolaerts A，Roux J，Ganter MT，et al. Serotonin decreases alveolar epithelial fluid transport via a direct inhibition of the epithelial sodium channel [J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2010，43（1）：99-108.

[17] Roux J，Kawakatsu H，Gartland B，et al. Interleukin-1beta decreases expression of the epithelial sodium channel alpha-subunit in alveolar epithelial cells via a p38 MAPKdependent signaling pathway [J]. J Biol Chem，2005，280（19）：18579-18589.

[18] Sloniewsky DE，Ridge KM，Adir Y，et al. Leukotriene D4 activates alveolar epithelial Na，K-ATPase and increases alveolar fluid clearance [J]. Am J Respir Crit Care Med，2004，169（3）：407-412.

[19] Fink MP，Kruithoff KL，Antonsson JB，et al.Delayed treatment with an LTD4/E4 antagonist limits pulmonary edema in endotoxic pigs [J]. Am J Physiol，1991，260（5）：R1007-R1013.

[20] Bastarache JA，Ong T，Matthay MA，et al. Alveolar fluid clearance is faster in women with acute lung injury compared to men [J]. J Criti Care，2011，26（1）：249-256.

[21] Laube M，Küppers E，Uh T，et al. Modulation of sodium transport in alveolar epithelial cells by estradiol and progesterone [J]. Pediat Res，2011，69（3）：200-205.

[22] Qi D，He J，Wa ng D，et al. 17β-estradiol suppresses lipopolysaccharide -induced acute lung injury through PI3K/Akt/SGK1 mediated up -regulation of epithelial sodium channel （ENaC）in vivo and in vitro [J]. Respir Res，2014，15（1）：1-12.

[23] Deng J，Wang D，Deng W，et al. The effect of endogenous angiotensin Ⅱon alveolar fluid clearance in rats with acute lung injury [J]. Can Respir J，2012，19（5）：311-318.

[24] Lecuona E，Trejo HE，Sznajder JI. Regulation of Na，KATPase during acute lung injury[J].J Bioenerget，2007，39（5）：391-395.

[25] Ma T，Fukuda N，Song Y，et al. Lung fluid transport in aquaporin-5 knockout mice[J].J Clin Invest，2000，105（1）：93-100.

[26] Bai C，Fukuda N，Song Y，et al. Lung fluid transport in aquaporin-1 and aquaporin-4 knockout mice [J]. J Clin Invest，1999，103（4）：555-561.

[27] Fukuda N，Ma T，Matthay MA，et al. Role of aquaporins in alveolar fluid clearance in neonatal and adult lung，and in oedema formation following acute lung injury：studies in transgenic aquaporin null mice [J]. J Physiol，2000，525（3）：771-779.

[28] Towne JE，Krane CM，Bachurski CJ，et al. Tumor necrosis factor-alpha inhibits aquaporin 5 expression in mouse lung epithelial cells[J].J Biol Chem，2001，276（22）：18657-18664.

[29] Su X，Song Y，Jiang J，et al. The role of aquaporin-1（AQP1）expression in a murine model of lipopolysaccharide-induced acute lung injury [J]. Respir Physiol Neurobiol，2004，142（1）：1-11.

[30] She J，Bi J，Tong L，et al. New insights of aquaporin 5 in the pathogenesis of high altitude pulmonary edema [J].Diagnost Pathol，2013，8（12）：969-985.

[31] Zhang ZQ，Song YL，Chen ZH，et al. Deletion of aquaporin 5 aggravates acute lung injury induced by Pseudomonas aeruginosa[J].J Trauma Acute Care Surg，2011，71（5）：1305-1311.

[32] Saadoun S，Papadopoulos M C，Hara-Chikuma M，et al.Impairment of angiogenesis and cell migration by targeted aquaporin-1 gene disruption[J].Nature，2005，434（7034）：786-792.