Claudin-7基因敲减细胞对裸鼠原位移植胰腺癌模型的致癌作用

刘 申，赵雪峰

(大连大学附属新华医院 普通外科，辽宁 大连 116021)

论 著

Claudin-7基因敲减细胞对裸鼠原位移植胰腺癌模型的致癌作用

刘 申，赵雪峰

(大连大学附属新华医院 普通外科，辽宁 大连 116021)

目的 研究Claudin-7基因敲减细胞对裸鼠原位移植胰腺癌模型的致癌作用。方法 采用Claudin-7基因敲减表达质粒和pcDNA6-Scramble空载质粒转染的人胰腺癌细胞BxPC-3建立裸鼠原位移植胰腺癌模型，裸鼠随机分为两组，即Claudin-7敲减组和阴性对照组。制模30 d后比较两组间成瘤情况，并采用病理学方法检测两组肿瘤细胞生长程度。结果 Claudin-7敲减组成瘤率和大体观肿瘤大小测量值明显高于对照组，两组间差异有显著性意义(P<0.05)。胰腺肿瘤组织的病理学检测发现肿瘤细胞生成率和肿瘤最大直径两组间差异有显著性意义(P<0.05)。结论 Claudin-7基因敲减能有效促进裸鼠原位移植胰腺癌模型的形成。

Claudin-7敲减；裸鼠；原位移植；胰腺癌

Claudin-7蛋白是构成紧密连接的重要成分，是影响紧密连接功能的关键蛋白之一。目前多数学者主张Claudin-7是潜在的抑癌基因[1]。近年来，Claudin-7对诸多原发癌抑制作用的研究非常活跃，但对于胰腺癌的研究报道极少[2]。本实验拟采用Claudin-7基因敲减表达质粒和pcDNA6-Scramble空载质粒转染的人胰腺癌细胞BxPC-3建立裸鼠原位移植胰腺癌模型，以观察研究Claudin-7基因敲减细胞对胰腺的致癌作用及其前临床意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物与材料

人胰腺癌细胞株BxPC-3 (Claudin-7基因敲减表达质粒转染组和pcDNA6-Scramble空载体质粒转染组) 由韩国CNU肿瘤研究所Young-Kyu Park教授捐赠。BAL b/c品系裸鼠20只，7周龄雌性，体重18～20 g，由韩国CNU实验动物研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 细胞培养及悬液制备：两组人胰腺癌细胞株BxPC-3分别在摄氏37 ℃、5%CO2，含10%血清RPMI 1640培养液中传代培养，每2～3 d换1次培养液。培养至80%～90%融合时，用0.25%胰酶消化液消化后，1200 r/min离心3 min，弃上清液，加无血清RPMI 1640培养液洗细胞2次，显微镜下计数，用无血清RPMI 1640培养液调整细胞浓度为2×107/mL。制备好的RPMI 1640和Matrigel (3∶1) 细胞悬液置于冰浴保存，待30 min内进行接种。

1.2.2 动物模型设计：制模前1周为实验动物安定期，防止进行对裸鼠的一切刺激性操作。实验动物共20只，随机分两组，分别为10只Claudin-7敲减组和10只对照组。

1.2.3 放大镜辅助下原位移植胰腺癌模型的建立：根据麻醉预实验结果，选择异氟醚进行全身麻醉。放大镜辅助下(Binocular lens， Heine， Germany)取上腹正中切口长约5mm，逐层入腹后小心牵拉大网膜并显露脾脏。在脾脏脏面寻找胰腺体尾部，采用31号针头在胰腺体尾部迷路进针约2 mm，缓慢注入BxPC-3人胰腺癌细胞悬液2×106/100 μL至胰腺被膜下，见注射部位胰腺被膜呈球状隆起，并在其内可见黄白色胰腺组织，拔针时用止血小纱布轻轻按压10 s后，关腹。建立模型全程应防止脾脏、胃及主要血管的损伤，也要防止注射部位肿瘤细胞的渗漏。

1.2.4 观察裸鼠指标：每天常规观察记录裸鼠状态，包括饮食、活动量、皮肤状态、排泄物观察期满30 d予以处死。裸鼠如出现频死前症状，应人道处死。处死后立即解剖观察腹腔内成瘤情况，具体记录胰腺肿瘤大小、淋巴结转移、血性腹水、腹膜种植转移及远处转移情况。所有胰腺病灶取出后充分固定在4%多聚甲醛中，行病理学检查证实。病理学检测首先观察大体的肿瘤形成率。胰腺包块假瘤在显微镜下观测中未见肿瘤细胞，考虑因部分肿瘤细胞注射到胰腺组织后转归为凋亡、无法着床、被排斥、炎性介导或形成废用性瘢痕。采取连续切片的方法来确定肿瘤最大直径。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理。实验数据以Mean±SD表示，组间比较采用Student’s t-test和卡方检验进行统计分析， 认为P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 成瘤情况

肉眼观察，两组无淋巴结转移、血性腹水及腹膜种植转移，见图1。Claudin-7敲减组成瘤率和大体观肿瘤大小与对照组比较，差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。

2.2 成瘤组织的病理学观察

胰腺肿瘤组织的病理学检测中，发现肿瘤细胞生成率和肿瘤最大直径两组间差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。显微镜观察发现，成瘤癌细胞为片状及巢状排列，形态呈椭圆形或不规则形，细胞分化程度低，核大，深染，核质比大，浸润性生长，其对照组肿瘤细胞生长相对局限，中央出现坏死区，见图2。

图1 Claudin-7敲减组和对照组的成瘤情况

表1 裸鼠原位移植胰腺癌模型的大体观和显微镜下观比较

3 讨 论

紧密连接蛋白家族的主要成员有Claudins、Occludins及连接支持分子。其中Claudins是形成紧密连接的跨膜糖蛋白，也是紧密连接结构及功能的重要组成成分。在正常生理环境中，细胞间的紧密连接扮演着构建和维护细胞的极性和屏障机能，一旦紧密连接被破坏可引发肿瘤单个细胞的脱落、粘附、降解及移动[3]。近年来研究发现Claudins在不同组织显示了截然不同的表达模式，其中Claudin-7在多种上皮来源的原发癌组织中，由于基因启动子被甲基化而导致表达明显下调，其基因的低表达增加了如结直肠癌等上皮来源肿瘤的浸润和转移能力[4]。因此，Claudin-7被认为是潜在的肿瘤抑制剂。此外，Claudin-7的表达与肿瘤患者的预后有关，Claudin-7的高表达明显提高肿瘤患者的生存率，并且Claudin-7的表达水平及临床分期是肿瘤患者预后的独立预测因素[5]。

图2 显微镜下Claudin-7敲减组和对照组的胰腺肿瘤组织情况

目前原位移植胰腺癌模型通常采用两种方法：(1)皮下种植的瘤块埋植到胰腺被膜外；(2)癌细胞注入到胰腺被膜下。经研究得出两种方法的成瘤率，前者成瘤率为100%，而后者成瘤率却为33%～100%[6]。本研究组曾尝试过先将人胰腺癌细胞接种到裸鼠皮下，待其成瘤后，再将皮下瘤块经无菌条件下取出，原位种植到裸鼠胰腺体尾部。其方法虽胰腺成模确切，但对其前临床观察和抗肿瘤药物筛选模型的制作有诸多阻碍。直接将人胰腺癌细胞注入到胰腺被膜下的原位移植胰腺癌模型的缺点为：(1)成瘤率低；(2)癌细胞沿注射针眼外溢而发生腹膜种植转移。为弥补这些缺点有人研发了微囊化人胰腺癌细胞建立胰腺癌模型方法，但其操作方法相对复杂[7]。本研究组全麻下将RPMI 1640和Matrigel (3∶1) 癌细胞悬液直接注入裸鼠胰腺制作原位移植胰腺癌模型，判断其模型可否值得前临床推广。此模型的优势在于：(1)癌细胞游动空间局限而成模稳定，也可防止术中、术后渗漏；(2)未采用腹腔内麻醉，使得癌细胞在腹腔内脏器的成活率倍增，加上操作完成后裸鼠方可立即活动，增加了癌细胞在腹腔内脏器的粘附和侵袭；(3)操作简便易行，且成瘤率高，能满足量化实验，值得前临床推广应用。值得强调的是，由于裸鼠自身胰腺解剖特点的制约，裸鼠原位移植胰腺癌模型是对注射部位要求较高的动物实验，应精准操作，同时配备放大镜或直筒显微镜。

本研究结果显示，Claudin-7敲减组能有效促进裸鼠原位移植胰腺癌模型的形成。两组模型解剖观察，发现两组模型均无淋巴结转移、血性腹水及腹膜种植转移，Claudin-7敲减组肿瘤生长相对迅猛，对照组肿瘤生长相对缓慢。Claudin-7敲减组肉眼观察成瘤率为90%，而显微镜下观察却发现成瘤率为100%。对照组肉眼观察成瘤率为30%，但显微镜下观察可发现成瘤率为50%。两组模型肿瘤大小差异显著。

综上所述，Matrigel癌细胞悬液直接注入裸鼠胰腺制作原位移植胰腺癌模型，操作简便、安全、可靠、有效并值得前临床推广应用。Claudin-7基因敲减可促进裸鼠胰腺癌的形成，但Claudin-7能否作为胰腺癌诊断标记物及治疗靶点有待于进一步证实。

特此，感谢韩国Young Kyu Park教授的捐赠。

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[5] Jun KH, Kim JH, Jung JH, et al. Expression of claudin-7 and loss of claudin-18 correlate with poor prognosis in gastric cancer[J]. Int J Surg, 2014， 12(2): 156-162.

[6] Hotz HG, Reber HA, Hotz B, et al. An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer[J]. Pancreas, 2003， 26(4): e89-98.

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Carcinogenic effects of Claudin-7 gene knockdown on the pancreatic cancer nude mice model by orthotopic implantation

LIU Shen, ZHAO Xue-feng

(DepartmentofGeneralSurgery,DalianUniversityAffiliatedXinhuaHospital,Dalian116021,China)

Objective To study the carcinogenic effects of Claudin-7 gene knockdown on the pancreatic cancer nude mice model by orthotopic implantation. Methods BxPC-3 pancreatic cancer cells transfected by recombinant clone vector plasmid-mediated Claudin-7 gene knockdown and blank vector pcDNA6-Scramble were used to establish the pancreatic cancer mice model by orthotopic implantation. The tumor bearing nude mice were randomized into 2 groups, Claudin-7 knockdown group and control group. After 30 days of the pancreatic injection, the pancreatic tumor formation was evaluated in two groups. The tumor cell growth in pancreatic tumor tissues were investigated by pathological detection. Results The tumor formation rate and tumor size of Claudin-7 knockdown group were significantly greater than that in the control group (P<0.05) by gross and microscopic examination. Conclusion Claudin-7 knockdown could have a stimulative effect on the tumor formation in pancreatic cancer nude mice model by orthotopic implantation.

Claudin-7 knockdown; nude mice; orthotopic implantation; pancreatic cancer

10.11724/jdmu.2015.06.09

刘 申(1978-)，女，辽宁朝阳人，主治医师。

赵雪峰，博士后，副主任医师。E-mail： zhaoxuefeng74@hanmail.net

R34

A

1671-7295(2015)06-0556-04

刘申，赵雪峰. Claudin-7基因敲减细胞对裸鼠原位移植胰腺癌模型的致癌作用[J].大连医科大学学报，2015,37(6)：556-559.

2015-06-21；

2015-11-12)