布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI1069基因的原核表达与分析

刘来珍，孙志华，刘娟，史静雪，陈创夫，张辉

（石河子大学动物科技学院/动物疾病防控兵团重点实验室，新疆石河子832003）

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI1069基因的原核表达与分析

刘来珍，孙志华，刘娟，史静雪，陈创夫，张辉⋆

（石河子大学动物科技学院/动物疾病防控兵团重点实验室，新疆石河子832003）

为构建布鲁氏菌分泌蛋白BMEI1069基因的原核表达载体，进行分析，分析该蛋白对胚胎滋养层细胞（HPT-8）细胞因子表达量的影响，本研究从羊种布鲁氏菌（B.melitensis）标准株16M的基因组中克隆BMEI1069基因片段，亚克隆到pMD19-T载体中并测序，构建表达重组质粒pET-28a-BMEI1069。转染大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达，采用Western-Blot方法检测其免疫学特性，用纯化的重组蛋白感染细胞，并检测细胞因子含量。结果表明，获得了pET-28a-BMEI1069原核表达载体，在大肠杆菌中表达了BMEI1069蛋白，经过SDS-PAGE检测，重组蛋白的分子量大约是58 kDa，western blotting检测显示具有免疫特性，细胞加入BMEI1069重组蛋白后细胞因子IL-1、IL-10和TNF-α的表达均高于PBS对照组，差异显著（P＜0.05）。本试验成功表达了布鲁氏菌分泌蛋白BMEI1069，证实其有一定的免疫特性，并且重组蛋白可以影响细胞因子的表达。这将为研究分泌蛋白在免疫逃逸和维持持续性感染的机制方面奠定基础。

布鲁氏菌；BMEI1069；原核表达；细胞因子；胚胎滋养层细胞

布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，又称地中海弛张热、马耳他热、波浪热或波状热，是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种动物源性的人畜共患的传染病[1-2]，患病的牛、羊等牲畜是主要的传染源。该病主要引起人的波状热和持续性感染，以及怀孕母畜流产和公畜睾丸不对称性肿大等临床症状[3]，严重影响畜牧业的发展和人类的身体健康[4]。目前还没有能够治愈该病的有效方法。布鲁氏菌是一种革兰氏阴性兼性胞内寄生菌，胞内寄生和复制是布鲁氏菌的主要毒力特征[5]。布鲁氏菌可以通过皮肤、消化道黏膜和呼吸道黏膜等途径侵入机体，随着淋巴液的循环到达淋巴结后被巨噬细胞吞噬[6]，巨噬细胞和胚胎滋养层细胞是布鲁氏菌主要的宿主细胞[7]。大量研究显示，布鲁氏菌分泌蛋白能够刺激机体产生较好的免疫反应，可作为布鲁氏菌病诊断性抗原和布鲁氏菌亚单位疫苗的候选靶标[8-9]，细菌的分泌蛋白是连接细菌和机体的桥梁，被认为是最有潜力的保护性抗原[10]，而且大多数的分泌蛋白在布鲁氏菌侵入宿主细胞的过程中都起着一定的作用，但是其具体的分子作用机制目前还不清楚。本研究选取羊布鲁氏菌分泌蛋白BMEI1069基因为研究对象，构建原核表达载体，通过检测其反应原性，以期为寻找布鲁氏菌的保护性抗原分子、免疫与诊断靶点等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和细胞羊种布鲁氏菌标准株16M、E.coli DH5α菌株、BL21（DE3）菌株、原核表达载体pET-28a菌株由石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存；pMD19-T载体购自Promega公司；人胚胎滋养层细胞（HPT-8）由第四军医大学军事预防医学系流行病学教研室提供。

1.2 主要试剂羊布鲁氏菌阳性血清由石河子大学动物疾病防控兵团重点实验室保存；IPTG购自Merck公司；限制性内切酶（BamHⅠ/XhoⅠ）、DNA marker、T4连接酶购自大连宝生物工程有限公司；细菌质粒小提取试剂盒以及琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限责任公司；HRP标记的兔抗羊IgG、蛋白Marker、BCA蛋白质定量试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM和血清购自美国Gbico公司；人的IL-1、IL-10和TNF-α检测试剂盒购自美国BD公司；其他试剂均为本实验室常用分析纯度的产品。

1.3 目的基因扩增根据GeneBank中羊种布鲁氏菌标准株16M的序列设计引物，由北京六合华大基因有限公司合成，序列见表1。

表1 PCR引物序列Table1 PCR primer sequences

以羊种布鲁氏菌标准株16M的灭活菌液（100℃金属浴灭活1 h）为模板，进行菌液PCR扩增，PCR的反应体系（20 μL）：2×Es Taq Master mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2 μL，去离子水7.2 μL。反应条件：预变性：94℃5 min，变性：94℃30 s，退火：61.6℃30 s，延伸：72℃30 s，后延伸：72℃7 min，共32个循环。反应结束后4℃保存。通过琼脂糖凝胶检测PCR产物，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。将回收后的目的片段与pMD19-T载体在16℃条件下过夜连接，构建重组质粒pMD19-TBMEI1069，重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，在氨苄抗性的LB固体培养基上进行阳性筛选，通过菌液PCR和双酶切鉴定阳性克隆，并将提取的质粒送上海生物工程技术服务有限公司测序。

1.4 原核表达载体的构建测序正确的菌株的质粒pMD19-T-BMEI1069以及pET-28a载体用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段和酶切后的线性pET-28a载体。将目的片段和线性pET-28a载体在T4连接酶的作用下16℃水浴过夜连接，连接产物转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经卡那抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆，进行菌液PCR和双酶切鉴定。

1.5 重组蛋白表达及表达条件的优化将筛选出的阳性克隆菌在LB液体培养基中，37℃，200 r/ min摇床中培养过夜。将过夜摇好的菌按1∶100的比例接种至新鲜LB液体培养基中，37℃，200 r/min培养1 h左右使其OD值为0.4～0.6，在其他条件不变的情况下，按照不同的诱导剂浓度（终浓度为0.1、0.2、0.6、1 mmol/L）、诱导不同时间段（0、4、6 h）进行诱导并收集菌体。将1 mL菌液离心弃上清，沉淀加入80 μL灭菌水和20 μL 5×SDS蛋白上样缓冲液，震荡混匀后沸水煮10 min，取20 μL样品进行15%SDS蛋白电泳。观察电泳结果，筛选目的基因的最佳表达条件。

1.6 重组蛋白纯化及浓度测定以最佳的诱导表达条件进行大量诱导表达。菌体裂解液经0.45 μm滤膜过滤后采用AKTA蛋白纯化系统纯化，A液（20 mmol/L磷酸二氢钠，500 mmol/L氯化钠，pH 7.4），B液（10 mmol/L磷酸二氢钠，250 mmol/L氯化钠，200 mmol/L咪唑，pH 7.4），将纯化后的蛋白液体装进透析袋放入PBS液体中进行透析，然后用蔗糖进行浓缩，用BCA法测定其浓度，-80℃保存，备用。

1.7 western-blotting检测重组蛋白对诱导表达并纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE后，转移到NC膜上，以200 mA的电流转膜1 h。将膜放入预先用TBST洗涤后的杂交瓶中，37℃封闭1 h，用TBST洗涤3次，每次10 min。加入1∶200稀释的布鲁氏菌阳性血清，4℃过夜孵育，用TBST洗涤3次，每次10 min，加入1∶5000稀释的辣根过氧化氢酶标记的兔抗羊IgG，37℃孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min。ECL显色后拍照。

1.8 蛋白感染细胞及细胞因子的检测将储存在液氮中的HPT-8细胞取出，使其在37℃温水中迅速融化，并转移至预先加有3 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液的离心管中，800 r/min离心5 min，弃上清，并用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37℃含5%CO2的恒温培养箱中培养，次日更换细胞培养液。待细胞长至约90%时，将细胞传至六孔板中继续培养。待细胞长至对数生长期时，更换细胞培养液，并加入经AKTA蛋白纯化系统纯化后的蛋白至终浓度60 μg/mL，作用24 h后取上清[10]，按照IL-1、IL-10和TNF-α试剂盒的说明书操作，用酶标仪测定OD450nm值，计算IL-1、IL-10和TNF-α细胞因子含量。用SPSS软件对所得数据进行单因素水平方差分析处理，并以不同处理方式为横坐标，以细胞因子含量为纵坐标，绘制每组试验3个重复样品的直方图。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增及酶切鉴定PCR扩增的BMEI1069片段大小为1 458 bp，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，与预期的大小一致，如图1所示。用相应的限制性内切酶进行双酶切，得到大小相符的基因序列，表明BMEI1069基因已成功插入表达载体中，如图2所示。

图1 PCR产物电泳图Fig.1 The electrophoregram of PCR products

图2 重组质粒双酶切鉴定Fig.2 The double enzyme identification of recombinant plasmid

2.2 重组蛋白表达条件的优化在其他条件不变的情况下分别以不同诱导剂浓度、不同诱导时间进行诱导，寻找最佳的诱导条件，结果显示IPTG的终浓度为0.1 mmol/L诱导6 h时重组蛋白表达量最高，如图3所示。大量诱导表达后经AKTA蛋白纯化系统纯化，SDS-PAGE分析表明纯化后的蛋白条带清晰，杂带较少，表明纯化效果较好，结果如图4所示。

图3 重组蛋白在IPTG诱导不同时间的SDS-PAGE结果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression protein induced at different time of IPTG

图4 SDS-PAGE电泳检测纯化后重组蛋白Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

2.3 western-blotting检测对诱导6 h的重组蛋白纯化后进行Western-blotting检测，200 mA恒流电流下转膜1 h，观察结果，可见明显的阳性条带，结果如图5所示。结果表明，诱导得到的重组蛋白能被HRP标记的兔抗羊IgG抗体识别，且大小与pET-28分子质量加上目标分子蛋白质量的重组蛋白总分子质量相符。

图5 表达产物的Western blot分析Fig.5 Western-blot analysis for the expressed protein

图6 细胞因子分泌量Fig.6 concentrations of cytokine

2.4 细胞因子检测按照IL-1、IL-10和TNF-α试剂盒的说明书操作，用酶标仪测定OD450nm值，计算IL-1、IL-10和TNF-α细胞因子含量。结果如图6所示，加入BMEI1069重组蛋白后IL-1、IL-10和TNF-α的表达均高于PBS对照组，差异显著（P＜0.05）。

3 讨论

布鲁氏菌病是一种古老的人兽共患病，严重危害人和多种动物的安全[12]，其致病菌还被一些国家列为恐怖战争武器之一[13]。布鲁氏菌是一种革兰氏阴性兼性胞内寄生菌，能够在宿主细胞中生存繁殖，这可能是由于布鲁氏菌自身产生的多种因子，阻止了溶酶体与吞噬小体的融合，并调控自噬、凋亡等一系列应激和防御机制，从而使布鲁氏菌逃脱宿主免疫系统的杀伤和清除；也可能是由于宿主细胞自身特异性宿主因子的产生有利于布鲁氏菌侵入宿主细胞，一旦宿主因子遭到破坏，将对布鲁氏菌的入侵及其胞内生存和繁殖产生影响。自2002年羊种布鲁氏菌16M参考基因组测序完成以来，已经有300多株布鲁氏菌基因组完成了测序，其中有16株基因组已经完成了精细物理图谱的绘制[14]。虽然对其基因和蛋白质的功能有了一定的了解，但是大部分蛋白质功能还不为人知，本文以布鲁氏菌的分泌蛋白BMEI1069为研究对象，为进一步全面解释布鲁氏菌蛋白质功能提供数据。

IV型分泌系统（type IV secretion system，T4SS）是与细菌接合机制有关的一类分泌系统。T4SS是一种跨膜的多亚单位复合物，通常包括一个由菌毛或其他表面纤维或蛋白质组成的分泌通道[15]。T4SS不但可以转运蛋白质，还可以转运一些核糖核蛋白复合物，这点区别于其他几种分泌系统[16-17]。细菌的分泌系统能将部分蛋白转运到胞质外环境，从而有利于细菌的胞内生存。对于致病性细菌而言，这些分泌性的蛋白帮助细菌发挥定殖、吸附等作用，还可以调理宿主细胞，逃逸宿主的免疫机制等[18]。杨羽等[19]通过运用生物学的方法预测布鲁氏菌16M菌株的分泌蛋白，得到了191个具有信号肽的蛋白；张沾等[7]通过对IV型分系统效应子VceC的研究表明VceC在侵染胚胎滋养层细胞过程中具有毒性作用。本研究中布鲁氏菌的BMEI1069重组蛋白感染细胞后可以引发细胞因子IL-1、IL-10和TNF-α的升高，这可能与布鲁氏菌侵染过程中引发的炎症有关，但需要进一步的证实。目前虽有关于T4SS、自噬和凋亡的研究，但是还没有关于T4SS与自噬和凋亡之间相互关系的研究。本文表达了布鲁氏菌的分泌蛋白BMEI1069并初步研究了其免疫特性，测定了该蛋白对细胞因子表达量的影响，为进行细菌侵染细胞和注射小鼠免疫试验打下了基础，同时也为进一步研究布鲁氏菌的免疫抑制机制、探索布鲁氏菌引发炎症提供一定的理论依据。

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Prokaryotic Expression and Analysis of BrucellaⅣSecretion System Protein BMEI1069 Gene

Liu Laizheng,Sun Zhihua,Liu Juan,Shi Jingxue,Chen Chuangfu,Zhang Hui*

（Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease,College of Animal Science&Technology,Shihezi University,XinjiangShihezi832003）

To construct a prokaryotic expression vector for BrucellaⅣsecretion system protein BMEI1069 gene,analyze effect of protein to the expression of Embryonic trophoblast’s cytokines, the BMEI1069 gene was obtained from Brucella melitensis 16M genome.It was connected to the vector of pMD19-T,and constructed recombinant plasmids pET-28a-BMEI1069.The pET-28a-BMEI1069 was transfected into E.coli BL21(DE3)to express,and was analyzed by Western blotting.The cells were infected by purified recombinant proteins,and detected cytokines levels.The results showed that the recombinant plasmids pET-28a-BMEI1069,and BMEI1069 protein has expressed in E.coli BL21 (DE3).The SDS-PAGE showed that the molecular weight of recombinant protein was about 58KDa,the Western blotting test showed that it had immunological characteristics，after adding BMEI1069 recombinant protein in cells,the expression of cytokines IL-1,IL-10 and TNF-α were higher than the control group of PBS,and the difference was significant(P＜0.05).The study has successfully expressed the BrucellaⅣsecretion system protein BMEI1069 gene,and the result showed that ithad immunogenicity.Recombinant protein can influence the expression of cytokines.This will be useful in mechanism researching of immune escape function and maintain persistent infection.

Brucella;BMEI1069;Prokaryotic expression;Cytokine;HPT-8

S855.1+2

B

1672-9692(2015)03-0006-06

2015-02-08

刘来珍（1988-），男，硕士，主要研究方向为布鲁氏菌致病机制。

张辉（1978-），男，副教授，从事传染病诊断与致病机制的研究。

国家自然科学基金(31460650)