益生菌发酵复方中草药工艺的研究

2015-10-13马明仑陈功义宋志元刘三侠张要齐

河南畜牧兽医 2015年20期

关键词：粪肠菌液球菌

马明仑，陈功义，宋志元，刘三侠，张要齐*

（1.新乡市畜产品质量监测检验中心，河南新乡　453003；2.河南农业职业学院；3.河南惠通天下生物工程有限公司）

益生菌发酵复方中草药工艺的研究

马明仑1，陈功义2，宋志元3，刘三侠3，张要齐3*

（1.新乡市畜产品质量监测检验中心，河南新乡453003；2.河南农业职业学院；3.河南惠通天下生物工程有限公司）

目前，我国畜禽养殖业抗生素的滥用现象日趋严重，其所导致的负面效应也日益显著。因此，开发安全、绿色、无毒的新型饲用抗生素替代品，对我国绿色畜牧业的发展意义重大。中草药饲料添加剂不仅能提高动物生产性能，而且还具有毒副作用小、残留低、无抗药性等优点，已成为目前研究的热点。发酵作为中草药的一种炮制方法，能提高中草药药效，降低毒副作用，同时产生新的药效物质。该研究选用黄芪、当归等中草药按比例组成复方，利用粪肠球菌对其进行发酵，以粗多糖含量和活菌数为检测指标，用单因素和正交试验相结合的试验设计确定其最佳发酵工艺，为新型饲用抗生素替代品的研制提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

菌种：粪肠球菌（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心）；药材与试剂：中药材（购自中药材市场）、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉（购自北京某生物技术有限公司），粪肠球菌肉汤培养基、粪肠球菌琼脂（购自青岛某生物技术有限公司），硫酸、乙醇、蒽酮以及其他试剂均为国产分析纯。

1.2试验仪器

中药粉碎机；超净工作台；数控超声波提取机；离心机；紫外分光光度计；高压蒸汽灭菌锅；电热恒温培养箱。

1.3试验方法

1.3.1菌种活化

挑取两环斜面保存的粪肠球菌于活化培养基中，37℃条件下培养20～24 h，至对数生长期菌液的浓度为0.8 108～1.0 108CFU/mL时，制备得到一级种子菌液，用于发酵中草药。

1.3.2复方中草药发酵培养基的制备

黄芪和当归粉碎后过80目筛，取复方中草药粉末10 g加入三角瓶中，然后加入100 mL蒸馏水，同时添加一定比例的葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无机盐等营养物质，搅拌均匀，调节pH值为7.0，115℃高压灭菌15 min，冷却后备用。

1.3.3复方中草药的发酵

将制备的一级种子菌液加入复方中草药发酵培养基中，用封口膜封好，在设定温度下培养，以粗多糖含量和活菌数为检测指标，筛选最适接菌量、发酵培养基初始pH值、发酵时间、发酵温度，再设计正交试验。发酵液中活菌数的测定采用平板菌落计数法。

1.3.4菌液接种量对复方中草药发酵的影响

向制备的复方中草药发酵培养基中接种一级种子液，菌液接种比例分别为1%、3%、5%、7%、9%、11%，发酵培养基初始pH值7.0，37℃条件下发酵培养72 h，发酵结束后测定粗多糖含量及粪肠球菌活菌数，确定最佳菌液接种量。试验分为四组，每组3个重复，下同。

1.3.5发酵培养基初始pH值对复方中草药发酵的影响

分别用0.5M HCl和0.5M NaOH调节复方中草药发酵培养基初始pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，高压灭菌，冷却后接种一级种子菌液，接种量由1.3.4节确定，用封口膜封好，37℃发酵培养72 h，发酵结束后测粗多糖含量及粪肠球菌活菌数，确定发酵培养基最佳初始pH值。

1.3.6发酵时间对复方中草药发酵的影响

接种一级种子菌液于中草药发酵培养基中，接种量由1.3.4节确定，发酵培养基初始pH值由1.3.5节确定，用封口膜封好，37℃条件下发酵培养，发酵时间分别为24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h，发酵结束后测定粗多糖含量及粪肠球菌活菌数，确定最佳发酵时间。

1.3.7发酵温度对复方中草药发酵的影响

接种一级种子菌液于复方中草药发酵培养基，接种量由1.3.4节确定，发酵培养基初始pH值由1.3.5节确定，发酵时间由1.3.6节确定，发酵温度分别为33℃、35℃、37℃、39℃、41℃，发酵结束后测定粗多糖含量及粪肠球菌活菌数，确定最佳发酵温度。

1.3.8正交试验优化复方中草药的发酵条件

在单因素试验条件下确定适合复方中草药发酵的菌液接种量、发酵培养基初始pH值、发酵时间和发酵温度的最适值。根据单因素试验结果，选取菌液接种量（A）、发酵培养基初始pH值（B）和发酵时间（C）3个因素，每个因素3个水平进行正交试验。发酵结束后测定粗多糖含量及粪肠球菌活菌数，确定最佳发酵工艺。

1.3.9葡萄糖标准曲线的绘制

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，置于100 mL的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，即得0.1 mg/mL葡萄糖标准品溶液。精密量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL的0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液置于预先编号的10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，然后分别吸取1.0 mL至具塞试管中，置冰水浴中5 min，再迅速加入现配的2%蒽酮-浓硫酸试剂4.0 mL，沸水浴中加热10 min，迅速置于冰水浴冷却5 min，室温静置5 min，另取蒸馏水1.0 mL，同样操作作为空白对照，在620 nm处测定吸光度值。通过对数据进行线性回归，得到回归方程Y=0.413X-0.015（R2= 0.9999）。

1.3.10粗多糖含量的测定

粗多糖的提取：中草药烘干后，粉碎，过80目筛，按比例配成12 g放入三角瓶中用玻璃棒搅拌均匀，在超净工作台中紫外照射30 min，然后准确称取0.5 g放入250 mL具塞三角瓶中，加入45 mL 80%乙醇静置浸泡30 min，并超声破碎30 min，过滤，多次用75%酒精洗涤药渣，弃去滤液；将滤渣放入烘箱中烘干，加入2%盐酸45 mL，沸水浴1 h，冷却后过滤到100 mL容量瓶中，重复提取1次，合并滤液，用2%盐酸定容，备用。

粗多糖含量的测定：采用蒽酮-硫酸法。测得发酵前中草药中粗多糖含量为8.32%。

1.3.11数据处理

试验所得数据用SPSS19.0进行处理分析。

2　结果与分析

2.1菌液接种量对复方中草药发酵的影响

图1　菌液接种量对复方中草药发酵的影响

不同菌液接种量对复方中草药发酵的影响如图1所示。由图1可知，菌液接种量为5%时，粗多糖含量和活菌数均达到最高值，随着接种量的继续增大，两者均有明显的降低。因此，单因素条件下5%为最佳菌液接种量。

2.2发酵培养基初始pH值对复方中草药发酵的影响

不同发酵培养基初始pH值对复方中草药发酵的影响如图2所示。当初始pH值＜7.0时，粗多糖含量和活菌数均随着pH值的增大而逐渐升高；当pH值为7.0时，两者均达最高。随着pH值继续升高，两者均逐渐下降。因此，单因素条件下pH值7.0为最佳发酵初始pH值。

图2　发酵培养基初始pH值对复方中草药发酵的影响

2.3发酵时间对复方中草药发酵的影响

图3　发酵时间对复方中草药发酵的影响

不同发酵时间对复方中草药发酵的影响如图3所示。由图3可知，随着发酵时间的延长，粗多糖含量和活菌数均不断升高，发酵72 h时，两者均达最高，继续发酵，活菌数大幅度下降，粗多糖含量也有明显下降。因此，单因素条件下72h为最佳发酵时间。

2.4发酵温度对复方中草药发酵的影响

不同发酵温度对复方中草药发酵的影响如图4所示。由图4可知，当温度为37℃时，粗多糖含量和活菌数均达到最高，当发酵温度继续升高时，两者含量降低并逐渐趋于稳定。因此，单因素条件下37℃为最佳发酵温度。

2.5正交试验优化复方中草药的发酵条件

由单因素试验确定正交试验各因素的水平值见表1，正交试验结果见表2。

图4　发酵温度对复方中草药发酵的影响

表1　正交试验因素与水平

表2　正交试验结果及极差分析

由表2可以看出，影响发酵后粗多糖含量及活菌数的三个因素的主次顺序为：C（发酵时间）＞A（菌液接种量）＞B（发酵培养基初始pH值）。最佳发酵工艺组合为：A2B3C2。方差分析结果表明，发酵时间和菌液接种比例对发酵后粗多糖含量影响差异极显著（P＜0.01），对活菌数的影响差异显著（P＜0.05），而发酵培养基初始pH值对两者的影响均不显著（P＞0.05）。综上可知，复方中草药最佳发酵工艺组合为菌液接种量5%，发酵培养基初始pH值为7.0，时间72 h，发酵温度37℃。测得此条件下发酵后粗多糖含量为12.26%，粪肠球菌活菌数为7.9 109CFU· mL-1。