钙离子通道β2亚基基因多态性与温州地区汉族人群脑卒中的关联性

王欣，陈婧，汪倩，林燕，牛宇欣，王晓欧，倪莉，杜兵，胡云良

（1.温州医科大学附属第二医院　检验科，浙江　温州　325027；2.温州医科大学附属第二医院　神经内科，浙江　温州　325027；3.美国佛罗里达大学，佛罗里达州　32610；4.烟台毓璜顶医院　检验科，山东烟台　264000）

钙离子通道β2亚基基因多态性与温州地区汉族人群脑卒中的关联性

王欣1，4，陈婧1，汪倩1，林燕2，牛宇欣3，王晓欧1，倪莉1，杜兵1，胡云良1

（1.温州医科大学附属第二医院检验科，浙江温州325027；2.温州医科大学附属第二医院神经内科，浙江温州325027；3.美国佛罗里达大学，佛罗里达州32610；4.烟台毓璜顶医院检验科，山东烟台264000）

目的：探讨钙离子通道β2亚基（CACNB2）基因多态性与温州地区汉族人群脑卒中的关联性。方法：收集原发性高血压患者413例、高血压合并缺血性脑卒中患者418例、高血压合并出血性脑卒中患者377例、正常对照355例。采取病例-对照相关分析方法，利用飞行时间质谱分型技术对CACNB2基因6个SNP位点（rs11014166、rs10764319、rs7099380、rs7069292、rs2228645、rs2357928）进行分型。结果：原发性高血压组、高血压合并缺血性脑卒中组、高血压合并出血性脑卒中组rs7069292 CT基因型频率及C等位基因频率明显高于正常对照组（CT基因型频率分别为6.05% vs 1.97%，6.94% vs 1.97%，6.36% vs 1.97%，C等位基因频率分别为3.03% vs 1.0%，3.47% vs 1.0%，3.18% vs 1.0%），差异有统计学意义（均P＜0.05）。原发性高血压组、高血压合并缺血性脑卒中组、高血压合并出血性脑卒中组CT基因型及C等位基因频率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。其余5个SNP位点各基因型频率及等位基因频率与对照组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论：CACNB2基因rs7069292多态性与温州汉族人群原发性高血压具有关联性，T＞C变异可能影响CACNB2功能，易患高血压。通过校正高血压影响，T＞C变异与脑卒中不具关联性。

钙离子通道β2亚基基因；多态性；脑卒中；高血压；汉族；温州地区

脑卒中是一组由于脑组织局部缺血或/及出血造成脑组织损伤为主要临床表现的疾病，在所有心血管疾病导致的死因中居于第二位［1］。根据中国心血管患者监测（WHO MONICA方案）发表数据，我国脑卒中以每年8.7%的速率增长，每年新发病例260万例［2-3］。有研究显示我国原发性高血压人群脑卒中的发生率较正常人群高5～30倍［4］，提示二者可能拥有共同的遗传易感基因。通过全基因组关联研究结果证实高血压的发生与钙离子通道在基因水平的单核苷酸多态性特别是其α1和β亚基基因多态性有着极为重要的相关性［5］。钙离子通道在由心肌和血管平滑肌收缩和舒张引起的血压变化过程中起着极为重要的作用，其β2亚基通过与α1C亚基结合来调节钙离子通道的电流强度、电压依赖性、激活与失活特性［6］。本研究通过飞行时间质谱法检测钙离子通道β2亚基（CACNB2）基因6个SNP位点基因多态性，分析各基因型频率及等位基因频率在温州地区汉族人群中脑卒中患者发病的遗传规律和特点，寻找与脑卒中具有关联性的脑卒中易感性钙离子通道基因多态性位点。

1　对象和方法

1.1研究对象

1.1.1病例组：于2010年3月-2011年8月在温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属第一医院、鹿城区人民医院等三所医院收集795例高血压合并脑卒中病例，其中高血压合并出血性脑卒中组377例，男243例，女134例，平均年龄（61.43±11.33）岁；高血压合并缺血性脑卒中组418例，男250例，女168例，平均年龄（63.82±11.40）岁。在上述单位体检中心、门诊收集原发性高血压病例413例，男274例，女139例，平均年龄（62.52±9.42）岁。缺血性脑卒中所有病例的选取均符合2010年《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》诊断标准；出血性脑卒中所有病例的选取均符合2007年《中国脑血管病防治指南》诊断标准。排除标准为：排除瓣膜性心脏病、房颤、血液病、肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等引起的脑卒中。原发性高血压患者入选标准：符合2010年《中国高血压防治指南》高血压诊断标准：未治疗前非同日3次测量，收缩压≥140 mmHg和/或舒张压≥90 mmHg者，或者血压＜140/90 mmHg，但正在服用降压药者。排除标准：包括肾脏病变、内分泌疾病引起的高血压、严重糖尿病、周围血管疾病、贫血、心力衰竭、严重肝功能障碍及其他不宜参加研究的患者。

1.1.2对照组：收集健康体检者共355例作为对照组，男219例，女136例，平均年龄（61.78±9.88）岁。纳入标准：收缩压＜140 mmHg，舒张压＜90 mmHg，并排除：①有心脑血管病或心脑血管病史者；②有脑卒中家族史者；③正在服用降压药或有过服用高血压药物史者、各种疾病所引起的低血压者。所有病例通过询问病史、检测临床生化相关指标，排除继发性脑卒中、严重肝肾功能不全、肿瘤等疾病。同时问卷调查年龄、性别，测量身高、体质量，并计算体质量指数（BMI=体质量/身高2）等资料。

1.2血标本采集与分析处理 采集研究对象空腹静脉血5 mL，其中2 mL EDTA·Na2抗凝，于-70 ℃冰箱冷冻保存，准备抽提DNA。另留3 mL用于血脂常规四项［总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）］、空腹血糖（FBG）等项目测定，BECKMAN-COULTER SYNCHRON LX-20型全自动生化分析仪上采用原装配套试剂检测。

1.3实验方法步骤

1.3.1DNA的制备：按Axyprep全血基因组DNA试剂盒说明书快速抽提全血基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测，产物置-20 ℃冰箱保存。

1.3.2引物合成：全部引物（6对PCR扩增引物及6条延伸引物）均由SEQUENOM公司的软件Assay Design 3.1程序设计，由北京擎科公司合成，见表1。1.3.3 PCR扩增及SNP分型：用多重PCR技术对所选的SNP位点的基因序列进行扩增（反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45个循环，72 ℃延伸5 min）。在上述扩增产物中加入SAP酶纯化并加入ddNTP，通过单碱基延伸引物（约20 bp）来实现SNP位点的扩增。按SEQUENOM公司的Manual进行实验操作。延伸完毕后，产物通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）基因分型技术，进行SNP分型。

1.4统计学处理方法 采用SPSS16.0统计软件。Hardy-Weinberg平衡检验所抽样本群体代表性，正态分布计量资料用±s表示，各组间比较采用单因素方差分析。计数资料比较采用x2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

表1　CACNB2基因6个SNP位点的PCR引物及延伸引物（5’→3’）

2.1高血压合并脑卒中组、原发性高血压组与对照组多指标比较 与对照组比较，高血压合并缺血性脑卒中组、高血压合并出血性脑卒中组及原发性高血压组均出现TG、FBG偏高，而HDL-C降低（均P＜0.05）；高血压合并缺血性脑卒中组、高血压合并出血性脑卒中组及原发性高血压组3组间比较TG、FBG差异无统计学意义（均P＞0.05）。4组间年龄、BMI、TC、LDL-C差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2　研究对象的基本指标比较

表2　研究对象的基本指标比较

与对照组比：aP＜0.05

组别　n　　年龄（岁）　BMI（kg/m2）　TC（mmol/L）　TG（mmol/L）　HDL-C（mmol/L）　LDL-C（mmol/L）　FBG（mmol/L）对照组　355　61.78± 9.88　23.76±1.87　5.33±1.05　1.58±1.20a　1.43±1.06a　3.07±1.54　5.49±1.29a原发性高血压组　413　62.52± 9.42　24.21±2.54　5.40±1.56　2.33±1.35a　1.25±0.59a　3.06±0.84　5.85±1.54a高血压合并缺血性脑卒中组　418　63.82±11.40　24.78±3.12　5.46±1.84　2.38±1.48a　1.22±0.52a　3.10±1.03　5.99±1.61a高血压合并出血性脑卒中组　377　61.43±11.33　24.46±3.33　5.38±1.76　2.26±1.73a　1.21±0.55a　3.15±1.24　5.93±1.73aF 1.750　1.940　1.760　2.490　3.16　0.054　3.880 P 0.081　0.053　0.077　0.013　0.02　0.950　0.000

2.2群体代表性检验 高血压合并缺血性脑卒中组、高血压合并出血性脑卒中组及原发性高血压组和对照组CACNB2 6个SNP位点基因型分布经x2检验，P＞0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明此4组研究对象具有群体代表性。

2.3CACNB2基因多态性质谱分析 SNP的分型结果为：rs11014166位点的基因型为AA、AT和TT；rs10764319位点的基因型为CC、CT和TT；rs7099380位点的基因型为AA、AG和GG（见图1-3）；rs7069292位点的基因型为CT和TT；rs2357928位点的基因型为AA、AG和GG；rs2228645位点的基因型为CC、CT 和TT。

图1　rs7099380A/G的质谱峰图

2.4各组CACNB2基因6个SNP位点基因型及等位基因分布频率比较 x2检验结果显示：原发性高血压组、高血压合并缺血性脑卒中组、高血压合并出血性脑卒中组rs7069292 CT基因型频率及C等位基因频率明显高于对照组（CT基因型频率分别6.05% vs 1.97%，6.94% vs 1.97%，6.36% vs 1.97%；C等位基因频率分别为3.03% vs 1.0%，3.47% vs 1.0%，3.18% vs 1.0%），差异有统计学意义（均P＜0.05）；原发性高血压组、高血压合并缺血性脑卒中组、高血压合并出血性脑卒中组CT基因型及C等位基因频率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。缺血性脑卒中组、出血性脑卒中组与原发性高血压组其余5个SNP位点基因型频率和等位基因频率与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3-4。

图2　rs7099380A/A的质谱峰图

图3　rs7099380G/G的质谱峰图

表3　4组间CACNB2各SNP位点基因型分布频率的比较　n（%）

3　讨论

脑卒中的高发病率、高病死率和高致残率给社会、家庭和患者带来沉重的负担和巨大的痛苦。流行病学研究表明，脑卒中是遗传易感性和环境因素共同决定的多基因遗传性疾病，存在基因-基因、基因-环境间相互作用，又称多因素疾病［7］。由于目前尚无治疗脑卒中的理想方法，因此寻找脑卒中相关危险因素，并采取积极干预措施具有特别重要的意义。

表4　4组间CACNB2各SNP位点等位基因分布频率的比较　 n（%）

近年来，脑卒中遗传致病基因主要集中在血管紧张素转化酶（ACE）基因、血管紧张素原（AGT）基因、载脂蛋白E（ApoE）基因、亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因、FV基因、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因、心钠素（ANP）基因等的研究［8-9］，虽然都证实与脑卒中的发病存在一定的相关性，但是其具体的作用机制仍不十分明确，还需要更进一步的科学研究。

目前已知的脑卒中危险因素中高血压为脑卒中首要且独立的危险因素，且收缩压每增加10 mmHg，脑卒中发病相对危险增加49%；舒张压每增加5 mmHg，脑卒中危险增加46%［10］。以上提示二者可能拥有共同的遗传易感基因，故近年来有关脑卒中候选基因研究较多集中于与血压调节和高血压有关的基因。

电压依赖型L型钙离子通道（voltage depandent calcium channel，L-VDCC）是触发心肌及血管平滑肌兴奋-收缩耦联的最主要Ca2+通道，由α1C亚基、β亚基、α2δ亚基和γ亚基组成［11］。β亚基有4个亚型（β1-β4），只有β2唯一构成心肌和血管平滑肌的L-VDCC，其与α1C亚基协同表达时，才能使电流逐级递增［12］，改变通道的电压依赖性，调节通道激活及失活动力学［13］。Grueter等［14］发现β2亚基Thr498的变异（Thr498Ala），能够阻止CamKI I介导L-VDCC开放，从而影响Ca2+内流所触发的兴奋-收缩耦联而影响血压变化。Buraei等［15］发现了一种新的蛋白通过与β亚基的结合来实现对钙离子通道的调节，推测β亚基可能可以独立执行对钙离子通道的调节。

本研究通过对中国温州地区汉族人群原发性高血压组与高血压合并脑卒中组CACNB2基因多态性差异表达，寻找与脑卒中具有关联性的脑卒中易感性钙通道基因多态性位点。我们选取CACNB2基因可能有功能意义的6个SNP位点，包括第1选择性转录启动子区域-1191C/T（rs10764319）、第2选择性转录启动子区域内含子的117383C/T（rs7069292）、119411A/G（rs7099380）、120036A/G（rs2357928）、第3内含子的279193A/T（rs11014166）及第14外显子的398766C/T（rs2228645）。

原发性高血压组、高血压合并缺血性脑卒中组、高血压合并出血性脑卒中组rs7069292 CT基因型频率及C等位基因频率明显高于对照组，携带CT基因型人群比TT基因型人群患高血压病、高血压合并脑卒中风险增加。rs7069292位于CACNB2基因的第2内含子区域，该区域包含1个含CACNB2基因选择性剪切的启动子，其点突变可能致使在转录过程中出现选择性剪切，进而影响基因的表达，引起蛋白质功能发生变化，导致CACNB2与α1C结合发生改变，影响L-VDCC的功能，进而影响到血压的变化。Antzelevitch等［16］发现CACNB2基因突变导致钙离子通道主要功能丧失，进而影响钙离子通道活性改变，引起血压的变化。我们对CACNB2的功能研究也证实了含rs7069292 C等位基因的启动子活性与含rs7069292 T等位基因的启动子活性相比明显增高，差异有统计学意义［17］。通过校正高血压病对脑卒中的影响，发现rs7069292基因多态性与脑卒中不具关联性。

其余5个SNP位点结果显示高血压合并出血性脑卒中组、高血压合并缺血性脑卒中组、原发性高血压组的基因型频率及等位基因频率与对照组相比，差异均无统计学意义（均P＞0.05），提示rs11014166、rs10764319、rs7099380、rs2228645、rs2357928等位点变异与高血压及脑卒中发病无相关性，可能不是高血压及高血压性脑卒中的遗传易感性SNP位点。

当然，本研究不能排除由于样本量少、抽样误差可能造成的影响，还需要进一步扩大样本量，长期随访基因位点变异者，进一步进行研究验证。

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（本文编辑：吴健敏）

Association between CACNB2 gene polymorphism and stroke of ethnic Han Chinese in Wenzhou region

WANG Xin1，4， CHEN Jing1， WANG Qian1， LIN Yan2， NIU Yuxin3， WANG Xiaoou1， NI Li1， DU Bing1， HU Yunliang1. 1.Department of Clinical Laboratory， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou， 325027； 2.Department of Internal Neurology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 3.University of Florida， USA Florida， 32610； 4.Department of Clinical Laboratory，Yuhuangding Hospital， Yantai， 264000

Objective: To explore the association between genetic polymorphism of CACNB2 and stroke of ethnic Han Chinese in Wenzhou region. Methods: Four hundred and thirteen cases of essential hypertension （EH）， 418 cases of high blood pressure with ischemic stroke， 377 cases of high blood pressure with hemorrhagic stroke and 355 normal controls were analyzed via cross-sectional case-control. Six SNP loci of genotypes of rs11014166， rs10764319， rs7099380， rs7069292， rs2228645， rs2357928 of CACNB2 were typed by MALDI-TOFMS. Results: Compared to the control， the frequency of the CT genotype and allele frequency C of rs7069292 in high blood pressure group， high blood pressure with ischemic stroke group and high blood pressure with hemorrhagic stroke group were significantly higher （the frequency of the CT genotype 6.05% vs 1.97%，6.94% vs 1.97%， 6.36% vs 1.97%， allele frequency C 3.03% vs 1.0%， 3.47% vs 1.0%， 3.18% vs 1.0%， P＜0.05）. There was no significant difference in the other 5 SNPs， P＞0.05. Conclusion: There is significant association between polymorphisms of CACNB2 and people with essential hypertension （EH） in Wenzhou region. T＞C may be a factor that affected the gene expression of CACNB2 and lead to high blood pressure. Mutation of T＞C has no relevance with stroke by correcting the influence of high blood pressure.

CACNB2 gene； polymorphism； stroke； hypertension； Han Chinese； Wenzhou

R743

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.003

2014-04-11

浙江省自然科学基金资助项目（LY12H09003）；温州市重大科研基金资助项目（Y20070038）。

王欣（1987-），女，山东淄博人，检验师，硕士。

胡云良，教授，硕士生导师，Email：hyl@wmu.edu.cn。