肝细胞肝癌中nectin-4蛋白的表达及其临床意义

孙广正，吴益磊，张海峰，李金海

（温州医科大学附属第三医院　普外科，浙江　温州　325200）

肝细胞肝癌中nectin-4蛋白的表达及其临床意义

孙广正，吴益磊，张海峰，李金海

（温州医科大学附属第三医院普外科，浙江温州325200）

目的：检测肝细胞肝癌（HCC）组织中nectin-4蛋白表达水平，分析其与HCC临床病理特征之间的关系。方法：采用免疫组织化学染色法检测36例HCC组织及10例正常肝脏组织中的nectin-4蛋白的表达情况，采用x2检验分析nectin-4蛋白表达水平与HCC临床病理特征之间的相关性。结果：HCC组织中nectin-4蛋白累积吸光度值为2.55±0.64，阳性区域面积值为8.96±1.57；正常肝脏组织组中nectin-4蛋白累积吸光度值为1.12±0.58，阳性区域面积值为5.12±1.43。HCC组织中nectin-4蛋白阳性表达量明显高于正常肝脏组织，差异有统计学意义（P＜0.01）。nectin-4蛋白表达量在不同性别、年龄组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；与组织病理分化程度（P＜0.01）、有无淋巴结转移（P＜0.05）均明显相关。结论：nectin-4蛋白在HCC组织中呈高表达，其表达水平与淋巴结转移、恶性程度密切相关。

肝脏肿瘤；细胞黏附；nectin-4；免疫组织化学

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床常见的恶性肿瘤之一，其不但发病率高，恶性程度高，预后差，且起病隐匿，早期诊断困难，术后易复发［1-2］，因此如何从分子水平对HCC进行早期诊断及预后的判断是目前研究的重点。nectin-4蛋白是新近发现的免疫蛋白超家族中的一员，其不仅参与细胞的黏附、裂解，而且与多种肿瘤细胞的发生、发展有着密切联系［3］。本研究通过检测HCC组织及正常肝脏组织中nectin-4蛋白表达情况，并分析相关临床病理资料，探讨nectin-4蛋白在HCC发生、发展中的作用。

1　资料和方法

1.1一般资料 收集自2004年8月至2014年8月间在温州医科大学附属第三医院住院行手术治疗的HCC患者的肝癌组织石蜡标本36例，其中男20例，女l6例，年龄35～77岁，平均56.2岁。收集同期因外伤致肝脏破裂接受手术的患者（无肝炎及肝硬化等疾病）的肝脏石蜡标本l0例，其中男6例，女4例，年龄19～65岁，平均40.2岁。所有病理切片均经两名高年资病理专家会诊确诊。HCC患者术前均未行放、化疗。HCC患者中l5例无淋巴结转移，21例有淋巴结转移；病理分化程度：高分化（G1）14例，中分化（G2）16例，低分化（G3）6例。

1.2 主要试剂 nectin-4羊抗人单克隆抗体购自美国Bio Basic公司，SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.3免疫组织化学SP法检测nectin-4蛋白的表达

石蜡切片脱蜡至水化，二甲苯、梯度乙醇（无水、95%、85%、75%）洗5 min，PBS冲洗3次，每次3 min。微波修复，高、中、低火各5 min，冷却至室温，PBS冲洗3次，每次3 min。室温（18～30 ℃）下用3%双氧水阻断内源性过氧化物酶20 min。5% BSA孵育20 min；去除PBS，每张切片滴加一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗3次，每次3 min。滴加二抗，室温孵育20 min。滴加链霉菌抗生素-过氧化物酶溶液，室温孵育20 min。自来水冲洗，苏木素复染、盐酸乙醇分化、温水返蓝。切片梯度乙醇脱水干燥、二甲苯透明，中性树胶封片镜检。PBS代替一抗作阴性对照。

1.4结果判读标准 胞浆着色呈棕黄色提示nectin-4蛋白表达阳性。采用彩色图像分析系统（Leica Biosystems 5.0，美国徕卡公司）对呈现图像进行分析：在HIS颜色模式下选中染色阳性区域，过滤背景干扰，测定累积吸光度（integral opticaldenisity，IOD）值及阳性区域面积（Area）值。每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性区域的IOD值和Area值，以每例5个视野的IOD值和Area值的平均值作为该例的测量值［4］。

1.5统计学处理方法 采用SPSS17.0统计软件行统计学处理。所得数据用±s表示，采用x2检验分析nectin-4蛋白表达水平与HCC临床病理特征之间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1nectin-4蛋白在肝脏组织中的表达情况 在HCC组织中，nectin-4蛋白呈强阳性表达，在正常肝脏组织中少量阳性表达（见图1）。nectin-4蛋白表达量为：HCC组，IOD值为2.55±0.64，Area值为8.96±1.57；正常肝脏组织组，IOD值为1.12±0.58，Area值为5.12±1.43。HCC组中nectin-4蛋白的阳性表达量显著高于正常肝脏组织组（P＜0.05）。

2.2nectin-4蛋白的表达与临床病理参数的关系

在HCC组织中，nectin-4蛋白的表达水平在不同性别、年龄组间的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而与有无淋巴结转移（IOD：t=2.17，P＜0.05； Area：t=2.06，P＜0.05）、组织病理分化程度（IOD：F=13.52，P＜0.01；Area：F=7.49，P＜0.01）均明显相关。见表1。

图1　nectin-4蛋白在肝脏组织中的表达（SP，×400）

表1　HCC临床特征与nectin-4蛋白的表达水平的关系

表1　HCC临床特征与nectin-4蛋白的表达水平的关系

临床病理参数　n　IOD　P　Area　P年龄（岁）＜55　12　2.51±0.68＞0.05 8.55±1.71＞0.05 ≥55　24　2.55±0.72　8.87±1.62性别男20　2.27±0.66＞0.05 8.44±2.11＞0.05 女16　2.19±0.68　8.32±1.98淋巴结转移阴性　15　2.05±0.54＜0.05 9.13±1.44＜0.05阳性　21　2.73±0.68　12.37±1.51病理分级G1　14　1.55±0.37＜0.01 7.43±1.07＜0.01 G2　16　2.81±0.46　9.55±2.12 G3　6　3.53±0.83　12.12±1.47

3　讨论

nectin-4蛋白是免疫球蛋白超家族中的一员，属细胞黏附分子，介导细胞间以及细胞与细胞基质间黏附与交联，已被证实在多种肿瘤细胞迁移、黏附、增殖过程中发挥重要作用［5］。人类的nectin-4蛋白多在胎盘组织中表达，以nectin-4蛋白为基础的细胞黏附的破裂，是E-钙黏蛋白介导的细胞黏附的裂解以及细胞分离的触发器［6］。nectin-4蛋白作为一种新发现的肿瘤相关抗原，已被证实在乳腺癌、卵巢癌的侵袭、转移过程中发挥作用，这提示其将来可能作为一种新的肿瘤标记物应用于临床［7-8］。本研究通过免疫组织化学的方法对HCC组织及正常肝脏组织中的nectin-4蛋白的表达情况进行检测，发现nectin-4蛋白在肝癌细胞的胞浆中集中表达，正常肝脏组织中表达量较少，说明nectin-4蛋白可能参与促进肝脏恶性肿瘤的发生、发展的病理生理过程。这与其在胰腺癌［4］、肺癌［9］中的研究结果一致。但具体机制目前尚不明确，也是我们下一步研究的重点。

本研究还发现，nectin-4蛋白的表达量与HCC患者的年龄及性别均无关（P＞0.05），但其表达量在有淋巴结转移的HCC患者肝脏组织中显著高于无淋巴转移者（P＜0.05），且分化越差、恶性程度越高的肿瘤组织，其nectin-4蛋白的表达量就越高，说明nectin-4蛋白的强表达可能促进恶性肿瘤细胞的分裂、增殖及侵袭能力，恶化肿瘤的生物学行为，促进肿瘤的进展。其机制可能与nectin-4蛋白强表达，可明显促进细胞中间连接体和紧密连接体形成的速度，从而加强恶性肿瘤细胞之间的黏附裂解能力有关［10-11］。Frenzke等［12］认为，nectin-4蛋白在以E-钙黏蛋白为基础的细胞黏附裂解及随后的细胞分离过程中发挥主导作用，通过对nectin-4蛋白外功能区的溶蛋白裂解，可导致80×103的细胞片段或33×103的跨膜和胞内片段增殖、分裂。另有研究［13］证实，nectin-4蛋白还可通过促进细胞转化从而促使恶性肿瘤细胞增殖、侵袭及转移。

综上所述，nectin-4蛋白参与了HCC的发生、发展过程，有可能作为HCC的早期诊断指标应用于临床。进一步研究nectin-4蛋白参与HCC肿瘤细胞增殖、转移等的机制可能为HCC的早期诊断、靶向治疗及预后监测提供新的方向。

［1］Vasavada BB， Chan CL. Rapid fibrosis and significant histologic recurrence of hepatitis C after liver transplant is associated with higher tumor recurrence rates in hepatocellular carcinomas associated with hepatitis C virus-related liver disease: a single center retrospective analysis［J］. Exp Clin Transplant， 2015， 13（1）: 46-50.

［2］吴之浩. 低氧应激对人肝癌细胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9表达的影响［J］. 温州医学院学报， 2012， 42（1）： 41-43.

［3］Mollo MR， Antonini D， Mitchell K， et al. p63-dependent and independent mechanisms of nectin-1 and nectin-4 regulation in the epidermis［J］. Exp Dermatol， 2015， 24（2）: 114-119.

［4］史光军， 张磊， 陈昊强， 等. Nectin-4在胰腺癌中的表达及其临床意义［J］. 中华普通外科杂志， 2010， 25（12）： 999-1001.

［5］Mateo M， Navaratnarajah CK， Willenbring RC， et al. Different roles of the three loops forming the adhesive interface of nectin-4 in measles virus binding and cell entry， nectin-4 homodimerization， and heterodimerization with nectin-1［J］. J Virol， 2014， 88（24）: 14161-14167.

［6］Birch J， Juleff N， Heaton MP， et al. Characterization of ovine nectin-4， a novel pest despetits ruminants virus receptor［J］. J Virol， 2013， 87（8）: 4756-4761.

［7］Athanassiadou AM， Patsouris E， Tsipis A， et al. The significance of Survivin and nectin-4 expression in the prognosis of breast carcinoma［J］. Folia Histochem Cytobiol， 2011，49（1）: 26-33.

［8］张萍， 柴守辉， 高媛， 等. Nectin-4与卵巢癌的关系及其意义［J］. 中国妇幼保健杂志， 2010， 25（3 4）： 5095-5098.

［9］Takano A， Ishikawa N， Nishino R， et al. Identification of nectin-4 oncoprotein as a diagnostic and therapeutic target for lung cancer［J］. Cancer Res， 2009， 69（16）: 6694-6703.

［10］ Nabih ES， Abdel Motaleb FI， Salama FA. The diagnostic efficacy of nectin-4 expression in ovarian cancer patients［J］. Biomarkers， 2014， 19（6）: 498-450.

［11］ Fortugno P， Josselin E， Tsiakas K， et al. Nectin-4 mutations causing ectodermal dysplasia with syndactyly perturb the rac1 pathway and the kinetics of adherens junction formation［J］. J Invest Dermatol， 2014， 134（8）: 2146-2153.

［12］ Frenzke M， Sawatsky B， Wong XX， et al. Nectin-4-dependent measles virus spread to the cynomolgus monkey tracheal epithelium: role of infected immune cells infiltrating the lamina propria［J］. J Virol， 2013， 87（5）: 2526-2534.

［13］ Mollo MR， Antonini D， Mitchell K， et al. p63-dependent and independent mechanisms of nectin-1 and nectin-4 regulation in the epidermis［J］. Exp Dermatol， 2015， 24（2）: 114-119.

（本文编辑：丁敏娇）

Expression of nectin-4 in hepatocellular carcinoma and its clinical significance

SUN Guangzheng， WU Yilei， ZHANG Haifeng， LI Jinhai. Department of General Surgery， the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325200

Objective: To study the nectin-4 expressions in hepatocellular carcinoma （HCC） and its clinical significance. Methods: The nectin-4 expression in 36 pairs of HCC tissues， and 10 samples of normal liver tissues were detected with immunohistochemical techniques. The relations of nectin-4 expression with the clinicopathologic parameters were analyzed. Results: The IOD and area of nectin-4 were 2.55±0.64 and 8.96±1.57 in hepatocellular carcinoma tissues， which were significantly higher than those in the normal liver tissues （P＜0.01）. The expression of nectin-4 was not correlated with patients demographics （P＞0.05）， and the protein expression was correlated with histopathologic grade （P＜0.01） and lymph metastasis （P＜0.05）. Conclusion: The high expression of nectin-4 in hepatocellular carcinoma tissues suggests that its high expression may be correlated with the malignant degree of the carcinoma， nectin-4 can be considered as a reference index of differentiation， metastasis and prognosis in hepatocellular carcinoma.

hepatocellular neoplasms； cell adhesion； nectin-4； immunohistochemistry

R753.2

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.12.007

2015-02-09

孙广正（1973-），男，浙江瑞安人，副主任医师。