辐射对甘蓝型油菜下胚轴再生的影响

范春丽，王 颖

（1. 郑州师范学院 生命科学学院，河南 郑州 450044；2. 广东石油化工学院化学与生命科学学院，广东 茂名 525000）

植物离体培养和诱发突变相结合是植物品质改良的途径之一[1]。以组织培养为基础的离体诱变技术能有效地筛选并可再生出遗传性稳定的突变植株[2]，离体培养可以促进变异的分离和纯化，缩短育种周期从而提高育种频率[3-4]。目前诱变与生物技术相结合已成为发展趋势，诱变技术的新发展与植物生物技术科学息息相关[5]。把植物生物技术引进到诱变育种中来，将使后者的处理对象从种子、植株或其他器官组织扩大到细胞与DNA 分子上，大大拓宽诱变处理的工作领域，推动诱变技术朝纵深方向发展，把诱变育种推到一个崭新的境界。随着分子生物学技术的发展，这些技术应用到植物诱变育种上来，使高等植物的突变机理在DNA 水平上得到深刻的阐明，从而可望解决植物诱变育种的定向突变问题。但是，关于诱变处理与组织培养合适结合方式，处理条件、时期及变异体的选择方式等一系列问题都有待进行广泛深入的研究，以形成新的育种途径。油菜是我国最重要的油料作物，但辐射对油菜离体培养效应的研究还没有报道，试验采用60Co-γ 射线对种子和预培养的外植体进行辐射，探讨辐射对下胚轴再生的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为两个甘蓝型黄籽油菜品种SH31 和K81，一个甘蓝型黑籽油菜品种P52，其中K81 为双单倍体。材料均由西南大学油菜研究中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 辐射种子 将种子装入小型塑料瓶中进行辐射，剂量率为1.809 7 Gy/min，剂量设置0、400、800、1200 Gy，辐射后种子用75%酒精处理1 min，无菌水冲洗后用0.1%HgCl2灭菌12 m in，无菌水冲洗3次，播种于无激素的MS 培养基上，培养7 d 后取无菌苗的下胚轴切成0.5～1 cm 的小段接种于预培养基，4 d 后，转入分化培养基培养，30 d 后统计出芽数。

1.2.2 辐射下胚轴 未经辐射的无菌苗培养7 d，取下胚轴切成0.5～1.0 cm 的小段接种于预培养基上，培养2～4 d 后辐射，剂量率为1.809 7 Gy/m in，剂量设置0、10、20、30、40、50、60、80、100 Gy。辐射后转入分化培养基，30 d 后统计出芽数。

2 结果与分析

2.1 辐射种子对下胚轴分化的影响

辐射后的种子经培养萌发出幼苗，切取下胚轴进行预培养，4 d 后转入分化培养基，从表1 中可看出，出芽率随着辐射剂量的增加而降低，辐射对愈伤组织诱导影响不大，分化受到较大的影响，经1 200 Gy 照射后下胚轴分化频率下降至62.90%，比对照低20.57个百分点。这表明，辐射种子降低了下胚轴的分化能力。

表1 辐射种子对下胚轴分化的影响

2.2 辐射下胚轴段对下胚轴再生的影响

切取无菌苗下胚轴经预培养后，用不同剂量的γ射线辐射，结果从表2 中可以看出，低剂量的辐射对愈伤组织诱导没有大的影响，但可促进芽的再生，10～30 Gy 辐射对芽的再生均有促进作用，以20 Gy 辐射效果最明显，再生频率提高近9个百分点，且比对照提前3～5 d 出芽。但是高剂量的辐射却抑制芽的再生，辐射后3 d，40 Gy 以上剂量照射的下胚轴均出现褐化现象，且芽再生率呈下降趋势；超过80 Gy 辐射，下胚轴褐化严重，愈伤组织很少形成，但仍有少量再生出芽；100 Gy 辐射后下胚轴大部分褐化死亡，外植体极少形成愈伤组织，也基本上没有芽再生；100 Gy照射后的，基本上没有芽再生。

2.3 不同品种对下胚轴辐射的影响

辐射对离体培养产生的效应，不同品种间差异很大，以40 Gy 辐射为例，在照射后3 d，K81 和SH31 就出现褐化现象，其中K81 在低剂量20 Gy 就出现褐化现象，P52 在40 Gy 照射后，仅出现轻微的褐化，从出芽率来看，黑籽品种P52 经照射后，出芽率降低13.02个百分点，SH31 降低31.43个百分点，K81 降低44.66个百分点，这表明不同品种对辐射的敏感性不同，P52更耐辐射。

2.4 预培养时间对下胚轴段辐射的影响

未经辐射处理的下胚轴预培养2 d 和4 d 对分化影响不大[6]，但预培养时间对下胚轴再生的影响很大。由表4 可看出，预培养2 d 后辐射，下胚轴再生频率明显低于预培养4 d 后辐射。并且剂量越高影响越明显，预培养2 d 后40 Gy 照射，出现大量褐化死亡，在80 Gy 以上没有再生出苗。这说明4 d 时间的预培养有利于降低辐射对外植体的损伤，从而有利于芽的再生。

表2 辐射下胚轴段对下胚轴再生的影响

表3 不同品种对下胚轴辐射再生的影响

表4 预培养时间对下胚轴辐射再生的影响

3 小结与讨论

近年来，组培技术和诱变技术相结合在农作物、蔬菜、果树和育种上大量应用，培育出不少新品种[7-11]。在水稻中低剂量的辐射愈伤组织，可提高愈伤组织的分化频率[12]，青菜预培养的外植体经低剂量辐射处理后能促进不定芽的再生[13]。另有研究表明，在大豆的基因枪介导转化中，低剂量的辐射处理可提高转化成功率。对于油菜再生和农杆菌转化的研究，已经取得了一定的进展，但普遍存在再生频率较低的现象。本试验结果表明下胚轴预培养4 d 后，采用20 Gy γ 射线辐射处理，可明显提高油菜下胚轴的再生频率，40 Gy 以上剂量处理预培养的下胚轴，再生频率开始下降，60 Gy 以上辐射处理，愈伤组织诱导和再生受到明显的抑制，80 Gy 辐射处理后没有再生出苗，这对后期筛选变异是很有意义的。不同品种在离体培养中对辐射的效应存在较大差异，其中黑籽油菜较黄籽油菜耐辐射，这与种子辐射的结果是一致的。

[1]廖飞雄，余让才，潘瑞炽.60Co-γ 辐射对菜心离体培养的影响[J].核农学报，2003，17（4）：264-268.

[2]陈力耕，胡西琴，沈立晓.脐橙离体辐射增强耐寒性研究[J].核农学报，2001，15（1）：11-14.

[3]崔德才，徐培文.植物组织培养与工厂化育苗.组织培养快繁技术结合诱变育种[M].北京：化学工业出版社，2003.210-218.

[4]夏英武.植物诱变育种的研究进展及其新的领域[J].核农学报，1995，16（1）：39-42

[5]夏英武，吴殿星，舒庆尧.植物诱变育种技术的研究进展及其新的领域[J].核农学通报，1995，16（1）：39-42.

[6]许本波，张学昆，殷家明，等.培养条件对甘蓝型黄籽油菜下胚轴的再生影响[J].中国油料作物学报，2003，25（4）：23-26.

[7]孙光祖，陈义能，张月学，等.辐射诱变与离体培养相结合选育抗赤霉病突变体的初步研究[J].核农学报，1993，14（5）：205-209.

[8]王仑山，王鸣刚，王亚馥.利用组织和细胞培养筛选耐盐突变体的研究[J].植物学通报，1996，13（2）：7-12.

[9]Lee Y I,Kang K K,Lee S J.Somaclonal variation induced by in vitro mutagensis in sweet potato[A].2nd Asia-Pacific Conference on Plant Celland TissueCulture（APCPCTC）[C].1996.90-96.

[10]申馥玉，邱庆树，王传堂，等.辐照花生离体果针组培诱变效应的研究[J].核农学报，1994，15（1）：6-8.

[11]刘智宏，胡张华，郎春秀，等.大豆幼嫩子叶离体培养及辐射处理配合基因枪遗传转化研究[J].核农学报，2001，15（5）：282-285.

[12]赵成章，孙宗修，戚秀芳，等.射线对水稻再生植株诱导及其性状的影响[J].细胞生物学杂志，1983，5（1）：21-23.

[13]范正琪，崔海瑞.辐照对青菜芽再生及转化频率的影响[J].核农学报，2003，17（5）：336-339.