乙醇回流法提取葛根黄酮的工艺优化研究

朱德艳（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

乙醇回流法提取葛根黄酮的工艺优化研究

朱德艳
（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

采用正交试验法优化乙醇回流法提取葛根黄酮的工艺研究。在单因素试验的基础上，选择回流温度、回流时间、料液比、乙醇体积分数四个因素，进行正交试验设计，评估了这些因素对葛根黄酮提取率的影响。试验结果表明最佳工艺参数为回流温度90℃，提取时间120 min，料液比1∶40（g∶mL），乙醇体积分数70%。在此条件下，葛根黄酮的提取率为1.62%。

葛根；总黄酮；提取；正交设计

葛根为豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，具有解肌、退热、生津、透疹、升阳、止泻之功效，主要治疗外感发热、头痛、高血压等疾病［1］。随着现代医药、食品科技的发展，葛根的使用价值越来越引起人们的关注［2］。我国葛根资源相当丰富，除

青海、西藏、新疆外，各省都有分布［3］。葛根的主要成分是黄酮类、异黄酮类、葛根淀粉等。

葛根黄酮主要成分包括葛根素、羟基葛根素、甲氧基葛根素、大豆甙等黄酮类化合物，还有三萜类、香豆素类等［4］。葛根黄酮含量大约占葛根总量的12%。葛根黄酮目前主要用于治疗心脑血管疾病，如高血压、高血脂、偏头痛、冠心病、心肌梗塞、心绞痛等症状。还可代替中成药中的中药葛根，同时葛根黄酮还可运用于保健食品，用于解酒、延缓更年期、糖尿病引起的并发症等领域［5］。

已报道的葛根黄酮提取方法有很多，如水提取法、有机溶剂提取法、碱液法、超声波法、微波萃取法、超临界萃取等［6-11］。葛根黄酮作为许多药物与保健品的主要功能成分具有重要价值，其提取与功能应用的研究是目前热点之一。韩剑等［12］采用正交试验对葛根药材的提取条件进行了优化；赵浩如等［13］综合分析几种方法后认为渗滤法是较为适宜的提取方法；彭游等［14］利用微波辅助萃取法提取葛根黄酮，效果良好；张喜梅等［15］采用超声波法从葛根中提取总黄酮；邢秀芳等［16］将葛根用纤维素酶加以分解，后用乙醇与正丁醇萃取得总黄酮；王星敏等［17］采用生物酶促发酵降解葛根废渣的植物组织，有效地提取葛根黄酮。本试验主要对乙醇回流法从葛根中提取葛根黄酮的相关工艺进行了研究，以期使湖北荆门地区的葛根资源得到更充分利用，为葛根深加工和综合利用提供理论依据和技术参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

葛根：湖北省仙之灵食品有限公司；芦丁标准品：中国药品生物制品鉴定所；体积分数为95%乙醇：武汉市洪山中南化工试剂有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠（均为分析纯）：天津福晨化学试剂厂。

1.2仪器与设备

F120型粉碎机：北京市永光明医疗仪器厂；SHZ-3循环水多用真空泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DK-98-ⅡA恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；AB104-N电子分析天平：上海梅特勒—托利多仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1绘制芦丁标准曲线［11］

称取芦丁0.1 g，加入体积分数为95%乙醇溶解定容至100 mL，再转移至1 000 mL容量瓶用水定容，分别吸取0、1 mL、2 mL、3 mL、4mL、5mL于6个10mL试管中，分别标号0、1、2、3、4、5、6。加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，静置6 min，加入0.3 mL10%硝酸铝溶液，静置6 min，再加入4 mL 4%氢氧化钠溶液，静置15 min。最后分别加入蒸馏水将6个试管补足至10 mL。在波长510 nm处，以0号试管中溶液作为空白液测定吸光度值，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘图。

1.3.2样品中葛根黄酮的测定

根据1.3.1中相关结果绘制芦丁标准曲线，得到线性回归方程。采用紫外可见分光光度计测定样品中葛根黄酮的吸光度值，利用线性回归方程得到葛根黄酮的质量浓度［4］，黄酮提取率计算公式如下：

式中：V为葛根黄酮提取液的体积，mL；M为葛根样品质量，g；C为标准曲线回归方程得到的葛根黄酮质量浓度，mg/mL。

1.3.3葛根黄酮的提取工艺流程及操作要点

葛根→预处理→粉碎→乙醇回流浸提→离心→上清液→定容→紫外分光光度计测定葛根黄酮含量

操作要点：取葛根适量，用清水清洗表面，除去相关泥土及表面污渍。将葛根放入干燥器60 min。用菜刀将葛根切成长宽高各1 cm小方块方便粉碎。粉碎葛根，称取5 g葛根样品若干份，备用。在不同温度、不同乙醇体积分数、不同回流时间、不同料液比等条件下回流。回流完成后分别用真空泵抽滤至固液完全分离，将抽滤的溶液放入烧杯中。用移液枪从5个烧杯中各取1 mL溶液置于5支不同试管中。另取一支空白试管，加入1 mL蒸馏水。在6支试管中各加入0.3 mL5%亚硝酸钠溶液，静置6 min，再各加0.3 mL 10%硝酸铝溶液，静置6 min，最后各加4 mL 4%氢氧化钠溶液，静置10 min，最后用蒸馏水将6支试管补足至10 mL。在波长为510 nm下测定吸光度值，并根据1.3.2计算样品中葛根黄酮的提取率。

1.3.4单因素试验

乙醇体积分数的确定：选择乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%、90%，在料液比为1∶40（g∶mL），回流温度70℃的条件下回流120 min，计算葛根黄酮的提取率。

回流温度的确定：选择回流温度为60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，在乙醇体积分数为70%，料液比为1∶40（g∶mL）条件下回流120 min，计算葛根黄酮的提取率。

料液比的确定：选择料液比分别为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL），在乙醇体积分数为70%，回流温度为80℃的条件下回流120 min，计算葛根黄酮的提取率。

回流时间的确定：选择回流时间为60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，在乙醇体积分数为70%，回流温度为80℃，料液比为1∶40（g∶mL）的条件下回流，计算葛根黄酮的提取率。

1.3.5正交试验设计

为了找寻最佳的提取葛根黄酮的最佳条件，在单因素试验的基础上，选择乙醇体积分数、回流温度、料液比、回流时间4个因素为考察因素，以葛根黄酮的提取率为评价指标，采用L9（34）正交设计来优化乙醇回流的条件，因素与水平见表1。

表1　葛根黄酮提取条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for flavonoids extraction condition optimization from radixPueraria

2　结果与分析

2.1芦丁标准曲线的绘制

以芦丁质量浓度（mg/mL）为横坐标（X）、吸光度值为纵坐标（Y），绘制标准曲线见图1。由图1可知，芦丁标准曲线回归方程为Y=9.894 3X+0.002 1，R2=0.994 5，结果表明芦丁质量浓度和吸光度值线性关系良好。

图1　芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2单因素试验

2.2.1乙醇体积分数对葛根黄酮提取的影响

图2　乙醇体积分数对葛根黄酮提取影响Fig.2 Effects of ethanol concentration on flavonoids extraction from radixPueraria

选取乙醇体积分数70%，回流温度70℃，回流时间120 min，考察不同的料液比对葛根黄酮提取率的影响。

由图2可知，在乙醇体积分数为50%～70%，随着乙醇体积分数增加，葛根黄酮提取率增大；乙醇体积分数为70%～90%，随着乙醇体积分数增加，葛根黄酮提取率减小。分析其原因为当乙醇体积分数增加时，溶液中葛根黄酮溶解增多，提取率增大；当乙醇体积分数＞70%时，葛根中多糖等其他物质开始溶解，从而影响黄酮的溶解，因此提取率减小。故提取葛根黄酮的最适宜乙醇体积分数为70%。

2.2.2回流温度对葛根黄酮提取的影响

选取料液比为1∶40（g∶mL），乙醇体积分数70%，回流时间120 min，考察不同的温度对葛根黄酮提取率的影响，结果见图3。

图3　回流温度对葛根黄酮提取的影响Fig.3 Effects of refluxing temperature on flavonoids extraction from radixPueraria

由图3可知，提取温度在60～80℃，随着温度的升高，提取液中有效成分浸出增加，葛根黄酮提取率增大；当温度＞80℃后，随着温度的升高，可能引起黄酮结构破坏，黄酮被氧化，从而黄酮提取率减小。故提取葛根黄酮的最适宜温度为80℃。

2.2.3料液比对葛根黄酮提取的影响

选取乙醇体积分数70%，回流温度80℃，回流时间120 min，考察不同的料液比对葛根黄酮提取率的影响，结果见图4。

图4　料液比对葛根黄酮提取影响Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on flavonoids extraction from radixPueraria

由图4可知，在料液比1∶20～1∶40（g∶mL），随着溶剂量的增加，葛根黄酮由内向外扩散速度加快，提取率就逐渐增大；当料液比＞1∶40（g∶mL）后，葛根黄酮的溶解基本达到饱和，黄酮扩散速度减慢，黄酮提取率不再增加。提取葛根黄酮的最适宜料液比为1∶40（g∶mL）。

2.2.4回流时间对葛根黄酮提取的影响

选取料液比为1∶40（g∶mL），乙醇体积分数70%，回流温度80℃，考察不同的回流时间对葛根黄酮提取率的影响，结果见图5。

图5　回流时间对葛根黄酮的影响Fig.5 Effects of refluxing time on flavonoids extraction from radixPueraria

由图5可知，在回流时间60～120min，随着时间的推移，黄酮提取率增大；在回流时间为120min时提取率最高；在回流时间＞120min后，由于加热回流的时间过长，黄酮类物质容易被氧化而破坏，这样会造成部分总黄酮的降解而导致提取率降低，提取葛根黄酮的最适宜回流时间为120 min。

2.3正交试验

表2　葛根黄酮提取条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for optimization of flavonoids extraction condition from radixPueraria

在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、回流温度、料液比、回流时间4个因素为考察因素，以葛根黄酮的提取率为评价指标，正交设计来优化乙醇回流的条件，结果与分析见表2，方差分析见表3。

根据表2正交试验结果得出，乙醇回流法提取葛根黄酮最佳组合为A2B3C2D2，即最适宜工艺条件为乙醇体积分数为70%，提取温度为90℃，提取时间为120 min，最适宜料液比为1∶40（g∶mL）。对结果影响因素大小B＞A＞C＞D，即影响葛根黄酮提取的因素大小为回流温度＞乙醇体积分数＞料液比＞回流时间。在此最佳条件下进行验证试验，葛根黄酮的提取率为1.62%。

表3　正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表3方差分析结果可知，结果显示因素A、B、C和D都对葛根黄酮提取率有极显著的影响（P＜0.01），4个因素对葛根黄酮提取的影响主次顺序为B＞A＞C＞D。

3　结论

乙醇回流法提取葛根黄酮工艺最佳参数为乙醇体积分数为70%，提取温度为90℃，提取时间为120 min，最适宜料液比为1∶40（g∶mL），在此最佳条件下其总黄酮提取率可达1.62%。影响葛根黄酮提取效果各因素的主次顺序为回流温度＞乙醇体积分数＞料液比＞回流时间，方差分析表明，提取葛根黄酮工艺中应关键控制回流温度和乙醇体积分数。乙醇回流法相对其他提取方法，操作步骤简单，设备要求低，生产周期短，可为大规模工业化生产葛根黄酮提供理论基础。

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Optimization of flavonoids extraction technology from radixPueraria

ZHU Deyan
（College of Bioengineering，Jingchu University of Technology，Jingmen 448000，China）

The flavoniods extraction form radixPuerariawas studied by ethanol-reflux method.Based on single experiments，temperature，time，material to liquid ratio，and ethanol concentration were selected as evaluation factors for orthogonal test.The effect of the factors on flavonoids extraction rate was investigated.The results indicated that the optimal extraction conditions were temperature 90℃，time 120 min，material to liquid ratio 1∶40（g∶ml）and ethanol concentration 70%.Under the optimized conditions，the extraction yield of flavonoids from radixPuerariawas up to 1.62%.

radixPueraria；flavonoids；extraction；orthogonal test

TS201.1

A

0254-5071（2015）11-0145-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.033

2015-09-19

湖北省荆门市科技局项目（2012YD05）

朱德艳（1977-），女，副教授，硕士，研究方向为生物制药技术。