腌制牛蒡盐卤中嗜盐菌群组成的研究

徐　静，顾晨艳，吴小晶，邓连婷，温洪宇*（江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州221116）

腌制牛蒡盐卤中嗜盐菌群组成的研究

徐静，顾晨艳，吴小晶，邓连婷，温洪宇*
（江苏师范大学生命科学学院，江苏徐州221116）

为了研究腌制牛蒡盐卤中嗜盐菌群物种组成，采用微生物学方法对腌制牛蒡盐卤进行多次逐级梯度稀释后涂布，最后通过划线纯化菌株；通过革兰氏染色观察细菌形态；经聚合酶链反应（PCR）检测，获得16S rRNA基因序列，进而进行序列比对分析，对菌株进行分子生物学鉴定。结果表明，从腌制牛蒡盐卤中筛选分离获得2株嗜盐细菌菌株，编号为X1和X2，其中X1菌株与腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）模式菌株的16S rRNA基因序列相似度为99.81%；X2菌株与人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）模式菌株的16S rRNA基因序列相似度为100%。腌制牛蒡盐卤中的优势菌株为腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）。

牛蒡；嗜盐菌；聚合酶链反应；系统发育树；菌群组成

牛蒡（Arctium lappaL.）为菊科草本类植物，其化学成分丰富，具很高的食用、药用和营养价值［1］。牛蒡有明显的降血糖、防治糖尿病肾病、抗病毒、抗肿瘤活性、镇咳作用及促有丝分裂、肝保护作用等［2］。低盐条件下腌制牛蒡，可以改善其品质、安全性和营养价值。腌制牛蒡的盐卤作为一种特殊的高盐环境，分布了多种嗜盐菌，分离鉴定这些嗜盐菌，对腌制牛蒡中微生物类群分析和食品安全的研究至关重要。

近年来，嗜盐菌由于其独特的生理生化特性而被学者广泛研究，大都以盐场、盐湖、海洋等地对嗜盐菌进行鉴定分析，腌制食品的盐卤是一种重要的盐生环境，分布了多种嗜盐菌。张琦等［3］对腌制盐卤进行了研究。嗜盐菌是一类生活在高盐度环境中的微生物，通常生长在盐湖、盐碱地、海水以及盐制品等高盐环境中［4］。分子生物学的发展，以16S rRNA序列分析为主的多相分类在嗜盐菌分类学的研究上起了重要作用［5］。由于嗜盐菌具有独特的结构组成、生理机能和遗传基因，很多研究者对其在酶工业、生物电子学、环境生物学、医药工业、能源开发等领域开展了应用研究［6］，嗜盐菌的潜在价值一直是人们关注的焦点。该文对腌制牛蒡盐卤中的嗜盐菌进行分离，研究菌落与菌体形态特征、16S rRNA基因序列、系统发育分析以及其分子生物学地位，确定腌制牛蒡盐卤中的嗜盐菌群的组成，为腌制食品中嗜盐菌的多样性及食品安全问题提供参考，为腌制牛蒡的风味和品质提供理论基础，有利于系统地调查嗜盐菌的菌种资源和丰富嗜盐菌的分类［7］，在腌制牛蒡的过程中可以提供食品安全指导，为保障食用者的安全做出贡献。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1样品采集

无菌操作采集某榨菜厂牛蒡榨菜腌制早期盐卤样品，于4℃冰箱保存。

1.1.2培养基

平板培养基：酵母膏10 g，蛋白胨7.5 g，柠檬三钠3 g，氯化钠100 g，氯化钾2 g，硫酸镁10 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121℃灭菌25 min后备用。

1.1.3化学试剂

溴化乙锭（ethidium bromide，EB）、草酸铵结晶紫、碘液、体积分数95%乙醇、番红：上海歌凡生科公司；上下游引物、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒：上海生工生物工程；PCR Master Mix、Loading Buffer、DNA Marker：大连宝生物制品有限公司；细菌基因组DNA快速提取试剂盒：上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2仪器与设备

TC-25/HPCR扩增仪：杭州博日科技有限公司；DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；TGL-16B型台式离心机：上海安亭科学仪器厂；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；THZ-C台式恒温振荡器：太仓市华美生化仪器厂；DHP-905 2型电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；Gel Doc XR凝胶成像系统：美国BIO-RAD公司。

1.3试验方法

1.3.1菌株的分离纯化

采用逐级梯度稀释方法，将卤水稀释液均匀涂布于含10%NaCl的平板上，37℃培养48 h后，挑取典型单菌落，继续采用逐级梯度稀释法涂布于平板，重复多次后，挑取单一菌落，革兰氏染色后，镜检观察细胞形态与着色是否均一。最后采用平板划线法，继续纯化传代3次后，转接于斜面，4℃冰箱保藏、备用。

1.3.2菌落、菌体特征

观察生长于平板的单菌落，包括形状、大小、颜色和表面特征等。采用革兰氏染色法，观察菌体的形状、大小与颜色。

1.3.3基因组总DNA的抽提、16S rRNA基因的PCR扩增

采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取菌株总DNA。

以菌体总DNA为模版，采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增16S rRNA基因，16S rRNA基因的PCR扩增体系参照沈露露等［8］的方法。前引物为27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'（对应于E.coli 16S rRNA基因的8～27个碱基位置），后引物1 492R：5'-CT ACGGTTACCTTGTTACGAC-3'（对应于E.coli16S rRNA基因的第1 492～1 510个碱基位置）［9］，对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增。PCR反应条件：首先，94℃预变性5 min，然后，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后，72℃延伸10 min。取25 μL PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测，采用BIO-RAD凝胶成像系统采集照片并记录结果。

1.3.4 16S rRNA基因序列测定和系统发育树构建

将胶回收后的PCR产物寄到南京思普金生物技术有限公司进行测序。在对16S rRNA基因序列进行相似性分析的基础上，采用Clustalx1.83与MEGA4.0等软件构建系统发育树，研究其分类学地位。

2　结果与分析

2.1形态分析

2.1.1菌落形态

从盐卤中分离纯化获得两株可在盐含量为10%的培养基上生长的细菌，编号为X1、X2，结果如图1所示。由图1可知，X1菌落形态呈黄色、圆形、表面湿润、隆起、菌落偏小。X2的菌落呈白色、圆形、表面光滑、隆起、菌落中等大小。

图1　X1、X2菌落形态Fig.1 Colony morphologies of strain X1 and X2

2.1.2菌体特征

细菌X1、X2经过革兰氏染色，在淮镜下观察，结果如图2所示。由图2可知，两株细菌均呈紫色，表明这两株细菌都是革兰氏阳性菌。两株细菌的形态均为球状。

图2　X1、X2菌株革兰氏染色结果Fig.2 Results of gram staining of strain X1 and X2

2.2 16S rRNA基因的PCR扩增产物与测序结果

对16S rRNA基因序列PCR扩增后的产物进行了1%琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis，AGE）、溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色、BIO-RAD凝胶成像系统观察，结果见图3。

由图3可知，X1、X2均有明显的亮带，通过与Marker比较，目的片段为1 500 bp左右，表明获得了目的基因。通过分析测序结果，将波峰重叠片段去除，选取有效片段，得到两株细菌的有效序列。

图3　PCR扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoretogram of PCR amplification products

2.3 16S rRNA基因序列相似度和系统发育树

对两株细菌X1、X2的16S rRNA基因序列进行BLAST分析和比对，然后利用Clustalx1.83与MEGA4.0等软件构建系统发育树，结果见图4。

图4　基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on the construction of 16S rRNA gene sequences

由图4可知，研究发现rRNA结构既具有高变性，又具有保守性。而rRNA的高变性能揭示生物物种的特征核酸序列，可作为属种鉴定的分子基础。因为rRNA的保守性能够反映生物物种之间的的亲缘关系，所以rRNA能为系统发育树重建的研究提供可靠依据［10-11］。其中，16S rRNA及其类似的rRNA基因序列是生物系统发育研究最为合适的指标［12］。当菌种16S rRNA基因序列的同源性低于93%～95%时，则可初步判断这两种菌属于不同属；同源性在95%～98%时，则可初步判断这两种菌属于不同种；同源性＞98%时，则可初步判断这两种菌属于同种［13］。

从系统发育树上分析来看：X1菌株与腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）聚为一支，所以两者具有亲缘性，而且序列的同源性为99.81%，进而可以认为X1菌株属于腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）。X2菌株与人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）聚为一支，所以两者具有亲缘性，而且序列的同源性为100%，进而可以认为X2菌株属于人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）。

3　结论

本研究从腌制牛蒡盐卤中分离得到两株嗜盐细菌，两者均为革兰氏阳性菌且都是葡萄球菌；根据嗜盐显示值范围（3%～15%）来看两者属于中度嗜盐菌［14］。分离得到的两株菌经16S rRNA基因序列分析后表明，X1菌株与腐生葡萄球菌（Staphylococcussaprophyticus）的序列同源性达到99.81%，X2菌株与人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）的序列同源性为100%。初步认为腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）和人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）是腌制牛蒡盐卤中的优势菌株。

人葡萄球菌为一种少见的条件致病菌［15］，作为大规模生产腌制牛蒡的食品安全检测依据还待进一步深入研究。通过分子生物学方法研究腌制食品中嗜盐细菌的多样性，丰富了嗜盐菌的物种资源，进一步为腌制食品中嗜盐菌的多样性做出贡献，为系统性地进行嗜盐菌的调查和分类提供参考。

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Research of halophilic bacteria community in the pickled burdock bittern

XU Jing，GU Chenyan，WU Xiaojing，DENG Lianting，WEN Hongyu*
（College of Life Science，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China）

Halophilic microflora in pickled burdock bittern was researched by microbiological methods and the strains was gradient diluted repeatedly，and purified by plate streak.Bacteria morphology was observed by gram staining.16S rRNA gene sequence ofhalophilic bacteriawas obtained by polymerase chain reaction.After comparing and analyzing gene sequence，the strain was identified by molecular biology.The results showed that two strains of halophilic bacteria screened and separated from pickled burdock bittern were named as X1 and X2 respectively.Strain X1 was similar to Staphylococcus saprophyticuswith sequence similarity 99.81%，and strain X2 is similar toStaphylococcus hominiswith sequence similarity 100%. The dominant strains in pickled burdock bittern wereS.saprophyticusandS.hominis.

burdock；halophilic bacteria；polymerase chain reaction；phylogenetic tree；microflora

Q93-33

A

0254-5071（2015）11-0119-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.027

2015-10-09

江苏省大学生实践创新训练计划（201410320026Z）

徐静（1992-），女，本科生，研究方向为嗜盐微生物。

温洪宇（1973-），男，副教授，博士，研究方向为环境微生物。