HPLC法测定黄金甲跌打生肌膏中龙血素B的含量

李春红，蒋明廉

（1.广西中医药大学2012级硕士研究生，广西 南宁　530001；2.广西壮族自治区食品药品审评查验中心，广西 南宁　530022）

理论探讨

HPLC法测定黄金甲跌打生肌膏中龙血素B的含量

李春红1，蒋明廉2

（1.广西中医药大学2012级硕士研究生，广西 南宁530001；2.广西壮族自治区食品药品审评查验中心，广西 南宁530022）

［目的］建立黄金甲跌打生肌膏中龙血素B的含量测定方法。［方法］采用HPLC法，色谱柱：Thermo C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈-冰醋酸（1→900）（40∶60），流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长：260 nm；进样量：20 μl。［结果］龙血素B在浓度42.88～857.6 μg间呈良好线性关系（r=0.999），平均加样回收率为100.32%，RSD为1.55%（n=6）。［结论］该方法重现性好，结果准确，可作为黄金甲跌打生肌膏的质量控制手段。

黄金甲跌打生肌膏；龙血素B；HPLC

黄金甲跌打生肌膏也称裕隆药膏，为广西兴安县谢裕隆医师治疗跌打损伤、软组织损伤、烧烫伤、风湿肿痛及各种开放性伤口的临床验方。该方是由龙血竭、当归、川芎、麻油等药经过油炸加工及高压消毒精制而成的黑色糊状膏，具有清热解毒、凉血活血、消肿止痛、祛腐生肌等功效。本文应用HPLC法测定黄金甲跌打生肌膏中龙血素B的含量，方法可靠，可作为黄金甲跌打生肌膏的质量控制方法。

1　仪器与试药

1.1仪器高效液相色谱（美国赛默飞，型号：U3000）；电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，型号：HHS-21-6）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司，型号：SHB-ⅢA）；电子天平（瑞士梅特勒，型号：AJ150）。

1.2试药黄金甲跌打生肌膏由广西中医药大学附属瑞康医院中药民族药研发基地提供（批号：20140325，20140425，20140525）；龙血素B对照品（供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所，批号：111558-200303）；乙腈为色谱纯；甲醇、冰醋酸为分析纯；超纯水。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Thermo C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Lot No：018-01-157）；检测波长：260 nm；流动相：乙腈-冰醋酸（1→900）（40∶60）；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；进样量：20 μl；理论塔板数以龙血素B计不低于10 000。

2.2对照品溶液的制备精密称取龙血素B对照品适量（0.01072 g），置10 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，移液管移取1 ml置100 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得浓度为10.72 μg/ml的对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备精密称取黄金甲跌打生肌膏3.00 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，于100℃水浴上回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液适量，以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4阴性样品溶液的制备按处方及工艺制备不含龙血竭的黄金甲跌打生肌膏，并按照“2.3”项方法制备阴性样品溶液。

精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液各20 μl，按“2.1”项色谱条件进样测定，结果龙血素B出峰时间在28.5 min左右，阴性样品对测定无干扰。色谱图见图1。

图1　HPLC色谱图

2.5线性关系考察取对照品溶液母液（浓度为1.072 mg/ml），以移液管移取1 ml置25 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得浓度为42.88 μg/ml的对照品溶液。分别精密吸取稀释后的龙血素B对照品溶液（浓度为42.88 μg/ml）0.5，1，2，4，8，10 ml 置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成龙血素B对照品系列浓度溶液。分别取上述6个浓度的溶液各20 μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积值，以峰面积（mAU）为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程为Y=0.748X+0.384，r=0.999。结果表明龙血素B在浓度42.88～857.6 μg间呈良好线性关系，结果见图2。

图2　龙血素B标准曲线图

2.6精密度试验取黄金甲跌打生肌膏（批号：20140425），按照“2.3”项方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定龙血素B峰面积值，RSD=0.42%（n=6），表明精密度较高，仪器测定可靠。结果见表1。

表1　精密度试验结果　（n=6）

2.7稳定性试验取黄金甲跌打生肌膏（批号：20140425），按照“2.3”项方法制备供试品溶液，于制备后0，2，4，8，12，24 h分别进样20 μl，测定龙血素B峰面积值，结果RSD为0.79% （n=6），表明供试品溶液在24 h内保持稳定，测定方法可靠。结果见表2。

表2　稳定性试验结果　（n=6）

2.8重复性试验称取黄金甲跌打生肌膏（批号：20140425）3.00 g，共6份，精密称定，按“2.3”项方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果龙血素B的平均含量为0.2799 mg/g，RSD为0.95%（n=6），表明本方法重复性好，结果见表3。

表3　重复性试验结果　（n=6）

2.9加样回收率试验称取已知龙血素B含量（0.2782 mg/g）的黄金甲跌打生肌膏（批号：20140425）1.50 g，精密称定6份，分别精密加入龙血素B对照品溶液（1.072 mg/ml）145 μl，按“2.3”项方法制备待测溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，平均加样回收率100.32%，RSD为1.55%（n=6），表明回收率高，方法可靠。结果见表4。

表4　加样回收率试验结果　（n=6）

2.10样品测定分别称取不同批次的黄金甲跌打生肌膏

3.00g，精密称定，按“2.3”项方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，测定龙血素B含量，计算方法为：CX=CRAX/AR（AX为供试品的峰面积，AR为对照品的峰面积，CX为供试品溶液的浓度，CR为对照品溶液的浓度）。结果见表5。

表5　黄金甲跌打生肌膏中龙血素B的含量测定（n=3）

3　讨论

3.1龙血竭具有活血散瘀、消炎止痛、收敛止血、生肌敛疮、补血益气等功效，用于跌打损伤、瘀血作痛、外伤出血［1］。其主要含龙血素A、龙血素B、7，4'-二羟基黄酮、白藜芦醇以及甾醇类和皂苷类化合物等成分［2-3］。其中以龙血素B（4-羟基-2，4，6-三甲氧基二氢查耳酮）为代表的二氢查耳酮类成分是其活血化瘀的主要有效成分［4-5］。本文参考文献［6-7］，采用HPLC法测定血竭中龙血素B的含量，经方法学验证，表明所建立的HPLC法专属性强、阴性无干扰，方法稳定可靠，且操作方便、快捷，能有效地控制该制剂的质量。

3.2文献［8-11］采取的流动相大都是乙腈-冰醋酸（1→90）水溶液系统（40∶60），而本实验比较了乙腈-冰醋酸（1→90）水溶液系统和乙腈-冰醋酸（1→900）水溶液系统，结果后者作为流动相时，龙血素B约在25 min出峰，分离度较好，色谱峰峰形较好，且较稳定，能够满足色谱定量要求。

3.3根据文献［10］的供试品溶液制备方法，分别对供试品提取量（2.0 g，3.0 g，5.0 g，10.0 g），提取方式（超声提取、回流提取），提取时间（30 min，1 h，1.5 h，2 h）以及提取溶剂量（15 ml，20 ml，25 ml，30 ml）进行考察，结果确定供试品提取方法为：精密称取黄金甲跌打生肌膏3.0 g，精密加入甲醇25 ml，于100℃水浴上回流1 h。

［1］王锦亮，李兴从，江东福，等.云南血竭的化学成分及抗真菌活性［J］.云南植物研究，1995，17（3）：336-340.

［2］胡迎庆，官飙，屠鹏飞.龙血树属植物化学成分及生物活性研究进展［J］.国外医学：植物药分册，2000，15（1）：5.

［3］卢文杰，王雪芬，脒家源，等.剑叶龙血树氯仿部分化学成分的研究［J］.药学学报，1998，33（10）：755.

［4］张庆云，朱辉，陈红英，等.龙血竭研究进展［J］.武警医学院学报，2004，13（1）：69.

［5］张静泽，胡迎庆，郭鹏.紫外分光光度法测定龙血竭中二氢查耳酮的含量［J］.中成药，2004，6（26）：505.

［6］周志宏，王锦亮，杨崇仁.国产血竭的化学成分研究［J］.中草药，2001，32（6）：484-485.

［7］王雪芬，卢文杰，陈家源，等.剑叶龙血树化学成分研究［J］.广西中医药，1993，16（1）：38-39.

［8］黄涵琦，张晓燕.HPLC测定龙血竭胶囊中龙血素B的含量［J］.中国医药导刊，2009，11（6）：1045-1046.

［9］李忠琼，向东.HPLC测定龙血竭中龙血素A和龙血素B的含量［J］.华西药学杂志，2005，20（4）：348-349.

［10］黄韵然，梁美宜，周毅生，等.HPLC法测定龙血竭结肠定位片中龙血素B的含量［J］.西北药学杂志，2012，27 （4）：329-331.

［11］蒋林，吴玉强，杨兴，等.高效液相色谱法测定龙血竭丸中龙血素B的含量［J］.时珍国医国药，2008，19（3）：552-553.

（编辑陈明伟）

理论探讨

R284.1

A

2095-4441（2015）03-0054-04

2015-05-28