液相色谱串联质谱法在检测鸡肉中环丙沙星残留的应用

吕小玲　管祖东　黄丽琴　李文迹　罗忠宝

（福建圣农发展股份有限公司技术中心　福建光泽　354100）

液相色谱串联质谱法在检测鸡肉中环丙沙星残留的应用

吕小玲管祖东黄丽琴李文迹罗忠宝

（福建圣农发展股份有限公司技术中心福建光泽354100）

建立了鸡肉中环丙沙星的高效液相色谱串联质谱测定方法，试样经EDTA-Na缓冲盐提取和净化后，C18柱HPLC进行分离，多反应选择离子检测。方法的回收率和变异系数分别在90%～110%和3%～10%。该方法对鸡肉中环丙沙星检测限为1μg/kg。

液相色谱串联质谱环丙沙星残留

环丙沙星为合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，具广谱抗菌活性，杀菌效果好，几乎对所有细菌的抗菌活性均较诺氟沙星及依诺沙星强2～4倍，对肠杆菌、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌、淋球菌、链球菌、金黄色葡萄球菌具有抗菌作用，全球广泛用于治疗人类及动物的各种细菌性疾病［1］。经研究发现由于滥用该药导致废水、生活垃圾等中该药残留浓度日益增加［2］，为此我国农业部、欧盟及日本等为控制合理使用该药，对环丙沙星的最高残留作了限定性要求［3］。检测动物源食品中氟喹诺酮类药物残留的方法有很多，目前，在鸡肉产品的检测中，常采用的方法是动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测---高效液相色谱法（农业部1025号公告14-2008）［4］。本研究建立了鸡肉中环丙沙星的高效液相质谱联用检测方法，该方法准确、灵敏度高，适合鸡肉中环丙沙星的快速确证分析，以便有效指导临床用药，确保食品安全。

1　材料与方法

1.1药品与试剂环丙沙星，含量99.0%，德国Dr. Ehrenstorfera公司。乙酸铵、甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯，柠檬酸、EDTA-Na为化学纯试剂。

1.2仪器与设备Agilent 6460液相色谱串联质谱仪；吹氮浓缩装置，北京八方；IKA MS 3 basic微型混合器；水浴恒温振荡器等实验室常用设备。

1.3样品前处理

1.3.1环丙沙星提取称取5 g试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中。加入Na2EDTAMcllvaine缓冲溶液，震荡提取5 min，以6 000 r/min离心5min。残留物用15mLNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液重复提取1次，合并2次上清液，用快速滤纸过滤，用一干净50mL塑料离心管中收集滤液，定容至50mL，待净化。

1.3.2净化方法将提取液10 mL过艾杰尔PEP小柱（150mg/6mL）。a）6mL甲醇+6mL水活化；b）上样；c）用6mL 5%甲醇淋洗；d）用6mL乙腈洗脱。准确移取洗脱液于氮气流下吹至近干，用流动相定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，置2mL样品瓶中。

1.4仪器参数与测定

1.4.1色谱测定条件a）色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，3.5μm×100 mm×2.1mm（id）；b）流动相：0.1%甲酸乙腈：0.005mol/L乙酸铵水溶液=13∶87。c）柱温：35℃；d）进样量：5μL。e）接口及离子化方式：ESI+AJS，正离子检测。干燥气10 L/min，干燥温度350℃，鞘气12 L/min，鞘气温度250℃，气体均为氮气；电离电压：4 000 V，各离子对的去簇电压、碰撞能CE见表1。

表1　质谱参数

1.4.2质谱条件见表1。

2　结果与讨论

2.1质谱条件的优化1μg/mL标准溶液在正离子模式下先进行一级质谱分析（Q1扫描），得到准分子离子峰 （M+1）即m/z332.0，优化去簇电压。对m/ z332.0进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，优化碰撞电压，然后对离子源温度、雾化气、气帘气等进行优化。再以多反应监测（MRM）负离子模式优化去簇电压、碰撞电压、碰撞室入口及出口电压等质谱参数。分别选择丰度较强的2个子离子为特征离子，以母离子与子离子组成监测离子对，进行定性和定量分析。

2.2样品前处理条件的选择鸡肉中富含蛋白和脂肪，基质干扰复杂，合适的前处理方法可以将待测组分与样品杂质较好地分开。本试验对传统方法进行优化，根据待测组分的性质选择EDTA-Na柠檬酸缓冲盐溶液提取，本试验对比3种不同pH（3.0、4.0、7.0）缓冲盐以及乙腈、0.1%甲酸乙腈作为提取液的提取效率，结果表明（见表2），pH4.0缓冲盐和乙腈提取较好，但有机试剂乙腈对人体及环境污染较大，故最终选用pH4.0缓冲盐作为提取液。该方法提取效率高、杂质少、回收率高、前处理相对简单，所采用有机试剂少，避免污染。

表2　不同提取液对鸡肉样品中添加环丙沙星提取回收率的影响（n=3）

2.3方法的定量限、回收率、重复性及线性范围在以上确定的测定条件下，配制标准系列（n=6），分析化合物的浓度比为X轴，以分析物的峰面积比为Y轴作标准曲线。结果表明，环丙沙星浓度在1～20 μg/L时，线性关系良好，其相关系数和回归方程为Y=2445.869948*X+573.162374，r2=0.992。在空白样品中添加环丙标准溶液，进行3个水平浓度的添加回收试验，每个浓度6个重复。结果见表3。

图1　空白鸡肉样品离子图

图2　添加1μg/kg环丙沙星样品离子图

3　结　论

表3　鸡肉样品添加回收率及精密度测试结果（n=6）

鸡肉中的环丙沙星残留可利用高效液相色谱串联质谱法进行快速测定，该方法非常适合于鸡肉中环丙沙星的快速定量定性分析，在1.0～100μg/kg添加水平范围内的平均回收率为92%～105.2%，相对偏差为3.8%～9.4%，方法检测限等指标满足国内外检测的相关要求。

［1］Bhandari A，Close L I，Kim W J，et al.Occurrence of ciprofloxacin，sulfamethoxazole，and azithromycin in municipal wastewater treatment plants［J］.Practice Periodical of Hazardous，Toxic，andRadioactiveW asteManagement， 2008，12（4）：275-281.

［2］Carmosini N，Lee L S.Ciprofloxacin sorption by dissolved organic carbon from reference and bio-waste materials［J］. Chemosphere，2009，77（6）：813-820.

［3］农业部.中华人民共和国农业部公告第235号［EB/OL］. （2002-12-24）.http：//yz.hz-agri.gov.cn/uploadFiles/2005-10/1130221564406.doc

［4］中华人民共和国农业部.动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测：高效液相色谱法［S］.农业部1025号公告-14-2008.

Determ ination of the residues of ciprofloxacin in chicken by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Lv Xiaoling Guan Zudong Huang Liqin LiWenji Luo Zhongbao
（Fujian sunner development CO.，LTD.，Guangze 354100）

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）method was developed for the quantitative determination of Ciprofloxacin respectively in the chicken.The ciprofloxacin in chicken were deproteinated with EDTANa Mcllvaine buffer followed by liquid-liquid extraction.Further clean-up was performed by solid phase extraction（SPE）through mixed mode columns（PEP-2 SPE）.The separation of the compounds was carried on a Agilent Eclipse Plus C18 column（C18，3.5 μm×100mm×2.1mm（id）by a gradient elution using 0.1%formic acid acetonitrile and 0.1%formic acid water asmobile phases.The analyzes were detected by tandem mass spectrometry in multiple reaction monitoring（MRM）mode with negative electrospray ionization.The ciprofloxacin quantified by internal standard method.The linear ranges were 1.0～20.0μg/L and the correlation coefficients were not less than 0.992.The average recoveries and relative standard deviations ranged from90%～110%and 3%～10%respectively at the spiked levels of 1，2 and 10μg/kg for the bothmarkers.The limit of quantitation（LOQ）was 1μg/kg.Themethod is sensitive，accurate and suitable for the determination and confirmation of chloramphenicols in chicken and eggs.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）ciprofloxacin residue chicken

A

1003-4331（2015）02-0018-03

福建省区域科技重大项目（2012N 3011）“规模化白羽肉鸡肉品生产兽药残留监控技术的研究与应用”资助。