牡蛎粗多糖对免疫应激大鼠TLR-4 m RNA表达水平的影响

岳　刚　黄志坚张儒雅　许翔宇

（福建农林大学动物科学学院　福建省动物工程实验室，福州　350002）

牡蛎粗多糖对免疫应激大鼠TLR-4 m RNA表达水平的影响

岳刚黄志坚*张儒雅许翔宇

（福建农林大学动物科学学院福建省动物工程实验室，福州350002）

目的：试验目的是研究牡蛎粗多糖对脂多糖（LPS）刺激雄性大鼠产生的免疫应激是否产生缓解效果。方法：选择30只成年SD大鼠，按照体重靠近的原则，随机分成5个试验组（即空白对照组，免疫应激对照组，牡蛎粗多糖高剂量组、牡蛎粗多糖中剂量组、牡蛎粗多糖低剂量组），每组6只雄性大鼠。空白对照组和免疫应激对照组饲喂基础日粮，牡蛎粗多糖高、中、低剂量组为基础日粮添加0.9%、0.6%、0.3%牡蛎粗多糖。饲喂28 d后，免疫应激对照组、牡蛎粗多糖高、中、低剂量组按体重计算腹腔注LPS 100μg/kg，空白对照组则注射相等量的生理盐水。于注射3 h后采血，剖检取肝脏、脾脏、肾上腺、淋巴结，用RT-PCR检测TLR-4 mRNA的相对表达量。结果：牡蛎粗多糖高剂量组、中剂量组、低剂量组和空白对照组肝脏、脾脏、肾上腺和淋巴结TLR-4mRNA的相对表达量与应激对照组相比出现极显著性降低（P＜0.01），而牡蛎粗多糖中剂量组、高剂量TLR-4mRNA的相对表达量较低剂量组更趋于生理状态下空白对照组的相对表达量。结论：LPS作为免疫原可以引起雄性大鼠产生免疫应激反应，在基础日粮中添加牡蛎粗多糖可以缓解免疫应激，且日粮中的添加量为0.6%～0.9%时，缓解效果较好。

牡蛎粗多糖免疫应激TLR-4大白鼠

狭义的免疫应激反应是说在动物接种疫苗后，动物所产生免疫应答的同时，其自身也受到一定范围的损伤，广义的“免疫应激”又称免疫激发，这包括亚健康状态下动物体受到的各种病原侵害［1］。袁志航等研究表明［2］，当动物机体受到免疫应激后体内IL-1、IL-6、TNF等发生改变使得动物机体食欲减退或者废绝，蛋白质转换速率增高，氮排泄增高，外周蛋白的分解加速，骨骼肌蛋白的沉积减少，肝急性期蛋白的合成数量增高，同时介导动物机体的脂肪代谢。胡婷等研究表明，从牡蛎中提取的多糖具有明显的降血压，抗凝血，抗血栓，提高机体的免疫功能和抗白细胞下降等作用［3］。陈艳辉等研究表明，牡蛎多糖对鼻咽癌细胞CNE-1和血管内皮细胞的生长增殖具有抑制作用［4］。而李江滨等研究表明牡蛎多糖能明显抑制MDCK细胞培养流感病毒的增殖，对利巴韦林抗流感病毒具有相加效应［5］。现在动物免疫应激方面面临着诸多的问题，如如何评估动物应激的行为学和生理学指标与动物福利之间的关系，动物自身拥有有很复杂的行为和生理学机制用来对付免疫应激，这种生物学变化在何时影响到动物机体健康，威胁到动物的繁衍等将作为我们今后很长一段时间需要研究的方向［6］。研究牡蛎多糖对免疫应激大鼠的作用将有效的解决以上几个难题。

1　材料和方法

1.1动物分组与设计选取30只雄性成年的大白鼠，平均体重在223.48 g，按体重靠近的原则，随机分成空白对照组，应激对照组，牡蛎粗多糖高、中、低剂量组，每组6个重复。空白对照组和免疫应激组饲喂基础日粮，牡蛎粗多糖高、中、低剂量组分别喂含有0.9%、0.6%、0.3%牡蛎粗多糖的基础日粮，试验期为28 d。试验前12 h断水断料，试验各组按每千克体重腹腔注射LPS 100μg，空白对照组注射等量生理盐水。于注射3 h后采血，剖检。

1.2材料LPS（大肠杆菌血清型O55：B5，Sigma公司），ELISA试剂盒 （Cusabio Biotech Co.，LTD），Trizol，Prime Script？RT reagent Kit Perfect Real Time （TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd），荧光试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），琼脂糖。

1.3测定方法

1.3.1样品处理采取的血液室温静置后，以3 000×g离心10min，分离血清置于-20℃保存；采血后随机取1只剖检，取淋巴结，肾上腺，脾脏，肝脏等，用锡纸包裹，液氮运输，-40℃保存，待测TLR-4mRNA的表达水平。

1.3.2引物的设计根据GenBank中收录号为NM_214379和 DQ845171.1的基因序列，利用primer5.0各设计引物一对，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

β-actin（扩增长度为 300）：Sense primers∶5' TGCGGAAGGATCATTAACGGA 3'；

Anti-sense primers∶5'AGTAGGAGAGGAGCGAGCGACC3'。

TLR 4（扩增长度为 101）：Sense primers∶5' TATCCAGAGCCGTTGGTGTATC3'；

Anti-sense primers∶5'CCACTTTCTCAAGGACAATGAAG3'。

1.3.3总RNA的提取和cDNA合成按照传统方法提取总RNA［7］，并检测总RNA的浓度和纯度。cDNA的合成按照Prime Script？RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒说明书进行。

1.3.4荧光定量PCR反应采用Bioteke Power 2× SYBR Real-time PCR Premixture荧光定量试剂盒，用CFX-96型Real-Time PCR扩增仪对反转录产物进行扩增。反应体系：10μL的2×Premix，浓度为10μmol/L的上下游引物各 0.4μL，模板 DNA 2μL，灭菌蒸馏水7.2μL，终体积为20μL。反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃变性30 s，40个循环。

2　结　果

从图1可知，与空白对照组相比，应激对照组肝脏、脾脏、肾上腺和淋巴结中TLR-4 mRNA的相对表达量极显著性升高（P＜0.01），而牡蛎粗多糖低剂量组TLR-4 mRNA的相对表达量在淋巴结、脾脏中显著性降低（P＜0.05），在肝脏和肾上腺中极显著降低（P＜0.01）；牡蛎粗多糖中剂量组TLR-4 mRNA的相对表达量在淋巴结、脾脏中显著性降低（P＜0.05），在肝脏和肾上腺中极显著性降低（P＜0.01）；牡蛎粗多糖高剂量组TLR-4 mRNA的相对表达量在淋巴结和脾脏中显著性降低（P＜0.05），在肝脏、肾上腺中极显著性降低（P＜0.01）。与应激对照组相比，牡蛎粗多糖高，中，低剂量组TLR-4 mRNA在肝脏、肾上腺、淋巴结和脾脏中的相对表达量极显著性降低（P＜0.01）。其中，当剂量为 0.6%～0.9%时 TLR-4mRNA相对表达量在肝脏、肾上腺、淋巴结和脾脏中更接近于空白对照组。

3　讨　论

图1　TLR-4在免疫器官中m RNA的相对表达量

刘士强［8］研究表明，LPS应激对断乳大鼠的免疫功能和血液生化指标可造成一定的影响。查阅相关文献表明，现在对于多糖可以缓解免疫应激的研究主要以血液炎性细胞因子和激素水平方面为主，而对于Toll样受体4（TLR-4（和免疫应激方面的研究较少。Toll样受体（Toll-like receptor，TLR（是模式识别受体家族中的一员。TLR4作为首先被发现同时也是最重要的TLR，不仅识别外源性配体如内毒素（LPS（、磷壁酸、肽聚糖等，还能识别内源性配体如热休克蛋白60、70，硫酸肝素片段等［9］。TLR-4不仅参与了原微生物介导的炎症反应，有研究发现其在组织或器官IR损伤的炎症反应中也发挥巨大作用［10］。现在在TLR-4的构造以及其所参与促炎反应、促进免疫细胞成熟分化及调节免疫应答等方面的研究比较清晰，TLR-4介导的信号转导途径包括髓样分化蛋白88（Myd88（依赖性和非依赖性，前者经过一系列的级联反应后导致NF-κB的活化，从而产生大量致炎因子如TNF-ɑ、IL-1、IL-6等［11-12］。后者主要是诱导干扰素-β和干扰素诱导基因的表达，并引起NF-κB的晚期活化，最终导致干扰素-β和干扰素诱导蛋白10等致炎因子的释放［13-14］。肝脏是机体内主要的解毒器官，聚集了大量的单核-巨噬细胞，对LPS刺激后所产生的炎症反应强烈［15］。肾上腺作为机体内重要的内分泌器官，由皮质和髓质构成，皮质可以分泌皮质醇，测量其中的皮质醇含量可以反映大鼠是否处于应激状态。脾脏和淋巴结是作为机体内比较大的免疫器官，是机体免疫应答发生的场所，对LPS刺激导致的免疫应激反应强烈，研究TLR-4在胸腺、脾脏和淋巴结中的表达量一定程度上可以反映大鼠在经过LPS刺激后机体内的免疫应激状况。与前者相对应正常生理状态下，动物机体存在着各种TLRs的负调控机制，从而维持免疫反应的平衡。机体为了保证TLRs介导正确的免疫应答，存在精确的负调控机制，及时抑制TLRs信号，维持机体的免疫平衡［16］。

试验发现，在免疫应激对照组中，TLR-4mRNA在肝脏、肾上腺、淋巴结和脾脏等部位均有表达，且免疫应激导致这些器官在3 h内的TLR-4 mRNA相对表达量极显著性上升。这与杭涛等［17］的研究一致，即小鼠失血后1 h心肌TLR2及TLR4基因的表达水平增高。与之相对比，饲喂牡蛎粗多糖的免疫应激组在肝脏、肾上腺、淋巴结和脾脏中TLR-4 mRNA的相对表达量与应激对照组比较极显著性降低，这与孙雪芳等的研究有一定的相似性，黄芪多糖能有效抑制LPS诱导的心肌肥大，表现为蛋白含量降低，体积减小；并能有效减少炎症反应，表现为TLR-4mRNA表达降低［18］。从试验结论可以看出，牡蛎粗多糖可以通过诱导动物机体负反馈调控TLR-4mRNA的表达和其炎性细胞因子的释放，从而防止炎性细胞因子过高对动物机体造成不可逆的损伤，从而缓解机体的免疫应激。由图1各组试验数据得出，高剂量组与中剂量组TLR-4的相对表达量更趋于生理状态下空白对照组的相对表达量，由此可以得出牡蛎粗多糖缓解免疫应激的最佳剂量处于0.6%～0.9%。

4　结　论

在大鼠基础饲粮中添加牡蛎粗多糖对于大鼠由脂多糖（LPS）刺激引起的免疫应激有缓解作用，经过试验数据分析可知当添加量在0.6%～0.9%时，可以表现出较好的缓解效果。

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Effects of oyster crude polysaccharides on TLR-4mRNA expression after immunological stress

Yue Gang Huang Zhijian*Zhang Ruya Xu Xiangyu
（College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University National Students'Innovation and Entrepreneurship Training Program，Fuzhou 350002）

Objective：Trial is to study oyster polysaccharide on lipopolysaccharide（LPS）stimulation ofmale rats to produce immune effects of stress are generated ease.Method：Select30 adult SD rats，in accordance with the principles ofweightnear random ly divided into five experimental groups（ie，the control group，the control group immune stress，oysters polysaccharide of high-dose group，middle dose group polysaccharide oysters，oyster polysaccharide low dose group）6 male rats.The control group and the control group fed the basal immunological stress diet，oysters polysaccharide of high，medium and low dose groups based diet supplemented with 0.9%，0.6%，0.3%oyster polysaccharide.After feeding 28 d，immune stress control group，oysters polysaccharide of high，medium and low dose groups according to body weightby intraperitoneal injection LPS 100μg/kg，blank control group were injected with an equal volume of saline.3 h after injection blood，necropsy take the liver，spleen，adrenal gland，lymph nodes，the relative expression by RT-PCR detection of TLR-4 mRNA.Result：High-dose group polysaccharide oysters，middle dose group and low dose group and the control group liver，spleen，adrenal glands and lymph nodes relative expression of TLR-4mRNA and stress compared to the control group had significantly decreased（P＜0.01），while the oyster polysaccharide dose group，high dose TLR-4mRNA expression levels relative to the lower dose group tends to bemore relative expression of the physiological state of the control group.Conclusion∶LPS as immunogens can cause an immune stress response in male rats，based diets can alleviate oysters polysaccharide immune stress and dietary dosage of 0.6%to 0.9%，the effect ismore ease Okay.

Oyster polysaccharides immunological stress TLR-4 Rat

A

1003-4331（2015）02-0008-04

2013年国家级“大学生创新创业训练计划”项目资助。

岳刚（1991-），男，甘肃榆中人，本科生，动物医学专业。E-mail：nongdayuegang@163.com。

黄志坚（1963-），男，福建惠安人，教授，从事动物疾病防治与保健。E-mail：huangzj1999@sina.com。