RP-HPLC同时测定健阳片中3种成分

校军彦，薛艳许，王小敏，刘新月

(神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430)

·中药工业·

RP-HPLC同时测定健阳片中3种成分

校军彦*，薛艳许，王小敏，刘新月

(神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430)

目的：建立同时测定健阳片中甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷3种成分的RP-HPLC方法。方法：Dionex Acclaim C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液；流速为0.8 mL·min-1，梯度洗脱；柱温为30 ℃。分别对线性关系、精密度、重复性、稳定性及加样回收率进行考察。结果：被测定的3种指标成分中甘草苷在0.036 4～0.546 0 μg(r=0.999 8)、甘草酸在0.321 2～4.818 0 μg(r=0.999 7)、淫羊藿苷在0.384 0～5.760 0 μg(r=0.999 9)线性关系良好；平均加样回收率在99.60%～100.76%(RSD≤2.0%)。结论：该方法简便、准确，重复性好，可为健阳片的质量控制提供参考。

健阳片；高效液相色谱法；甘草苷；甘草酸；淫羊藿苷

健阳片收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第八册，由蜈蚣粉、淫羊藿提取物粉、甘草提取物粉及蜂王浆4味中药组成。其作为纯中药制剂具有补肾益精、助阳兴萎的功能，用于治疗肾虚阳衰引起的阳萎、早泄等性功能低下症，疗效显著。

原质量标准中，仅采用总氮法对含氮量进行控制，对具有补脾益气、调和药性作用的甘草提取物只有鉴别控制，对具有补肾阳、强筋骨功能的淫羊藿提取物没有控制。为了更好地控制健阳片质量，有必要对原质量标准进行升级。笔者查阅健阳片质量标准研究的相关文献，没有发现使用HPLC同时测定多指标成分的相关报道，本试验采用梯度洗脱法，首次建立了RP-HPLC同时测定甘草苷、甘草酸和淫羊藿苷3种指标成分的方法。结果表明，该方法简便、快速、灵敏度高，为健阳片的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技公司，包括四元泵、自动进样器、UV检测器)；赛托利斯CPA225D电子天平(十万分之一)；舒美KQ300DA型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

甘草苷、甘草酸铵、淫羊藿苷(中国食品药品检定研究院，批号分别为111610-201106，110731-201317，110737-200415)；健阳片(神威药业集团有限公司，规格：0.64 g，批号分别为1405152，1405162，1405172，1405182，1405192，1405202)；乙腈(色谱纯，Fisher公司)；超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Dionex Acclaim C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，按表1规定进行梯度洗脱；流速：0.80 mL·min-1；检测波长：237 nm；柱温30 ℃；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱条件

2.2 混合对照品溶液制备

精密称取对照品适量，加70%乙醇溶解，配成质量浓度分别为0.018 2、0.160 6、0.192 0 mg·mL-1的甘草苷、甘草酸(甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.020 7)、淫羊藿苷的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液制备

取本品10片，除去糖衣，精密称定，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL称重，超声处理(功率为250 W，频率为40 kHz)30 min，放置至室温，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 空白对照溶液制备

根据健阳片的生产工艺标准，取蜂王浆、蜈蚣粉以及相关辅料制得健阳片阴性样品，按照2.3项下方法制得空白对照溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察 按照2.1、2.2、2.3项下方法进行试验，结果供试品中各待测成分色谱峰的分离度均大于1.5，对照品、样品及空白对照品的色谱图见图1。

注：A.空白对照品；B.混合对照品；C.样品；1.甘草苷；2.淫羊藿苷；3.甘草酸。图1 健阳片及其对照品高效液相色谱图

2.5.2 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液2、5、10、15、20、30 μL，注入液相色谱仪测定。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程，甘草苷：Y=36.523 5X+0.096 9，r=0.999 8，线性范围0.036 4～0.546 0 μg；甘草酸：Y=12.909 1X+0.425 6，r=0.999 7，线性范围0.321 2～4.818 0 μg；淫羊藿苷：Y=33.337 5X+1.265 8，r=0.999 9，线性范围0.384 0～5.760 0 μg。结果表明各化合物在各自的进样范围内线性关系良好。

2.5.3 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，每次10 μL，记录峰面积，甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.46%、0.53%、0.34%，表明精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样10 μL测定，结果甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.79%、0.74%、0.56%，表明处理后的样品中各待测成分在8 h内基本稳定。

2.5.5 重复性试验 取同一批样品(批号：1405152)，按2.3项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷含量分别为0.636 6、2.518 7、4.864 0 mg/片，RSD分别为0.65%、0.67%、0.56%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验 精密称取6份已知含量的样品(批号：1405152)细粉适量，精密加入适量的甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷对照品，按2.3项下方法制备所需溶液，按2.1项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表2～4。

表2 甘草苷加样回收率试验

表3 甘草酸加样回收率试验

表4 淫羊藿苷加样回收率试验

2.6 样品测定

取6批健阳片，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1色谱条件进样测定，采用外标法计算，结果见表5。6批样品批与批之间甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷含量差异较小，可以有效地控制健阳片的质量。

表5 健阳片中指标性成分的含量(n=2，mg/片)

3 讨论

本次试验比较了甲醇、乙醇、70%乙醇等不同提取溶剂的提取效果，结果70%乙醇对甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷提取效率均较高；同时，考察了超声提取法、加热回流提取法，其中超声提取法提取时间更短，产率也较高，可在室温下进行，操作方便。故本文选用超声提取法。

取3个对照品的混合溶液和供试品溶液，在200～400 nm进行紫外扫描，结果在237 nm波长下，3个成分均有较大吸收，且该波长下各成分分离度良好，故确定237 nm为检测波长。

由于甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷极性差异较大，等度洗脱难以实现同时分离，故采用梯度洗脱方式。试验考查了多种流动相系统对分离的影响，结果乙腈-0.05%磷酸溶液系统梯度洗脱分离效果较好，基线平稳，峰形对称。

方法学研究表明，本方法具有良好的精密度、准确度和重复性，能够同时测定甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷的含量，可有效地控制健阳片的质量。

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SimultaneousDeterminationofLiquiritin，GlycyrrhizicAcidandIcariininJianYangTabletsbyRP-HPLC

XIAOJunyan，XUEYanxu，WANGXiaomin，LIUXinyue

(ShinewayPharmaceuticalGroupLtd.，Shijiazhuang，Hebei051430，China)

Objective：To develop an RP-HPLC method for simultaneous determination of liquiritin，glycyrrhizic acid，icariin in Jian Yang Tablets.Methods：The chromatographic separation was achieved on a Dionex Acclaim C18column (250 mm×4.6 mm，5.0 μm) with acetonitrile-0.05% phosphate as mobile phases at the flow rate of 0.8 mL·min-1for gradient elution，and the column temperature was 30 ℃.Its linear relationship，precision，repeatability，stability，and recoveries were investigated.Results：The seven components were well separated and showed good linearity，such as liquiritin 0.036 4-0.546 0 μg(r=0.999 8)，glycyrrhizic acid 0.321 2-4.818 0 μg(r=0.999 7)，icariin 0.384 0-5.760 0 μg(r=0.999 9).The average recoveries were between 99.60% and 100.76% (RSD≤2.0%).Conclusion：The method is simple，accurate and repeatable.It can be applied to the quality control of Jian Yang Tablets.

Jian Yang Tablets；HPLC；liquiritin；glycyrrhizic acid；icariin.

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.019

2015-02-10)

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校军彦，工程师，研究方向：药品质量控制与检验；Tel：(0311)88030066-6595，E-mail:swyyxiy@163.com