基于PB-CCD设计的固肠止泻丸HPLC-DAD指纹图谱研究△
2015-09-25刘妍如吕杨宋忠兴张岁玲唐志书刘力王兴海
刘妍如,吕杨,宋忠兴,张岁玲,唐志书,刘力*,王兴海
(1.陕西中医学院 陕西省中药资源产业化协同创新中心,陕西省中药基础与新药研究重点实验室,陕西 咸阳 712083;2.陕西中医学院制药厂,陕西 咸阳 712083)
·中药工业·
基于PB-CCD设计的固肠止泻丸HPLC-DAD指纹图谱研究△
刘妍如1,吕杨1,宋忠兴1,张岁玲1,唐志书1,刘力1*,王兴海2
(1.陕西中医学院 陕西省中药资源产业化协同创新中心,陕西省中药基础与新药研究重点实验室,陕西 咸阳 712083;2.陕西中医学院制药厂,陕西 咸阳 712083)
目的:以Plackett Burman-Central Composite Design(PB-CCD)设计为基础,通过分析固肠止泻丸的高效液相指纹图谱,完善其质量控制和评价方法。方法:基于试验优化设计(DOE,Design of Experiment)原则,采用PB-CCD方法优化液相分析中的多种因素。样品采用Agilent 5 TC-C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),0.2%甲酸/水-乙腈溶液线性梯度洗脱,以280 nm作为检测波长,计算10批固肠止泻丸及中间体指纹图谱的相似度,评价各批样品质量。结果:建立了固肠止泻丸的高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)指纹图谱,确认了21个共有峰,其中8个为主要成分色谱峰(标定峰)。结论:基于PB-CCD设计建立的固肠止泻丸HPLC-DAD指纹图谱分析方法,标定峰分离度较好,可用于该复方制剂加工过程中的质量控制。
固肠止泻丸;试验设计;高效液相色谱法;指纹图谱
固肠止泻丸源自医圣张仲景经典名方“乌梅丸”,成方由乌梅、干姜、黄连、罂粟壳、木香、延胡索组成。具有调和肝脾,涩肠止痛,解痉,止泻的功能[1-2]。目前研究建立的固肠止泻丸HPLC定量分析方法大多只反映方剂中黄连的盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、延胡索乙素等生物碱类成分,其他单味药材中的成分很少体现[3-6],也还没有基于试验优化设计(DOE,Design of Experiment)方法来研究固肠止泻丸指纹图谱的报道[7-8]。
本研究基于Plackett Burman-Central Composite Design(PB-CCD)设计,首先对影响指纹图谱质量的液相色谱关键因素进行优化,然后利用优化后的液相条件,建立反映固肠止泻丸中主要成分信息的高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)指纹图谱,为固肠止泻丸的质量控制提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1260 型高效液相仪(包括配脱气机、G1311C四元梯度泵、G1329B自动进样器、G1316A柱温箱、G1315D DAD检测器);佑科FA2704b型分析天平(上海佑科仪器仪表有限公司);KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。
1.2 材料
乙腈为色谱纯(Honeywell公司,批号分别为DK268,DK364);甲酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司,批号:20140421);其余试剂均为分析纯;水为娃哈哈纯化水。
固肠止泻丸(陕西中医学院制药厂,批号分别为141201,141202,141204,141205,141206);中间体(陕西中医学院制药厂,批号分别为141201,141203,141204,141205,141206);对照品咖啡酸、盐酸罂粟碱、延胡索乙素、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、6-姜辣素、异欧前胡素(中国食品药品检定研究院,批号分别为110885-200102,171214-201205,110726-201414,110733-201108,110732-201309,110713-201212,111833-201303,110827-201109)
2 方法
2.1 固肠止泻丸供试品溶液配制
根据《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第二十册(WS3-B-3870-98)对固肠止泻丸样品的处理方法,取固肠止泻丸,研细,取粉末约0.5 g,精密称定,置25 mL具塞三角瓶中,加甲醇溶液20 mL,超声处理30 min,将提取液转移至蒸发皿中,待溶剂蒸干后,再用0.1%甲酸水-乙腈(90∶10)溶液边洗涤边转移至50 mL容量瓶中,直至将蒸发皿内残渣完全洗净,最后用0.1%甲酸水-乙腈(90∶10)溶液定容至刻度,摇匀,0.22 μm滤膜过滤,取续滤液,作为供试品溶液。
2.2 色谱条件
Agilent 5 TC-C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱(100 mm×4.6 mm,3.5 μm);流动相:水(A)-乙腈溶液(B)。
2.3 影响因子设计
采用比例特定的乙腈-水混合洗脱系统,以不同比例甲酸调节流动相系统pH值。选用不同色谱柱类型、检测波长、柱温、线性梯度时间、流速、乙腈初始比例作为考察变量,以两峰分离度之和∑Rs、归一化分离因子r*(×10-10)、色谱信息量Ф和色谱分层响应效能HCRF作为响应因子,见表1[9]。
表1 影响因子及响应因子设计表(7因素2水平)
2.4 数据分析
以各因素无相互作用且对设计结果干扰少作为设计前提,采用Design-Expert Version 8.0.7统计软件,首先对检测波长、柱温、梯度时间、进样体积、流速、酸浓度、乙腈初始比例进行PB因子筛选;然后以CCD响应曲面法对重要因素进行寻优,以确定最优的参数设置,见表2。
2.5 方法学验证
按照《中华人民共和国药典》2010版一部对中药质量控制方法的规定,对优化结果进行精密度、重复性、稳定性等方法学验证。以咖啡酸、罂粟碱、延胡索乙素、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、6-姜辣素和异欧前胡素为对照,鉴定指纹谱中主要成分。
表2 PB设计试验方案(n=3)
3 结果与讨论
3.1 液相色谱优化因子选择
由于甲醇和分析物间氢键的相互作用,可能引入额外的共振结构并可能引起拖尾峰,因此选择乙腈作为有机相。另外,色谱柱温度也是影响极性化合物保留时间的重要参数,一般温度升高,扩散系数也升高,这样会导致更窄的峰和更高的分离效率。为了增加色谱柱使用寿命,将柱温优化范围设置为25~40 ℃。
3.2 PB试验设计
为了在最少的试验次数下获得最佳的参数设置,选择因子设计中的PB法作为筛选设计方法,以CCD响应曲面法对优化后的因素进行进一步优化,以∑Rs、r*(×10-10)、Ф、HCRF评价样品的分离效能,见公式1~3。结果见表3。
公式1
公式2
HCRF=1000000n+10000Rmin+(tm-t1)
公式3
其中,R表示两峰间分离度;n为理论塔板数;Rmin为最小分离度;tm-t1为最大与最小保留时间差;A为色谱峰面积。
∑Rs、r*(×10-10)是用于评价色谱分离质量的参数;Ф值指色谱信息量值,是用于评价色谱交互信息的参数;HCRF指分层色谱响应值,用于评价方法中分离峰个数、分离度和分析时间性能。
表3 PB响应因子结果
PB试验的ANOVA结果显示,Ф和HCRF项的p值分别为0.004 3和0.005 4,均小于0.01,说明各变量与HCRF回归方程的关系非常显著。拟合系数(R-Squared)分别为0.992 4和0.991 1,说明模型拟合度很好。
根据各影响因子对各响应因子的最大值运算结果,将影响不显著的影响因子进行最大值预测并作为固定条件:检测波长为280 nm;柱温为40 ℃;流速为1.0 mL·min-1;甲酸浓度为0.2%;色谱柱类型为250 mm×4.6 mm,5 μm。
3.3 CCD试验设计
在PB设计结果的基础上,对进样体积、线性梯度和乙腈初始比例因素进行寻优。试验采用通用旋转组合设计(Rotatable=6),以Ф和HCRF作为响应因子进行三水平CCD试验,结果见表4。
从Ф和HCRF项的ANOVA分析结果中可以看出,对Ф影响显著的因素为进样体积(p=0.000 3)和线性梯度时间(p=0.003 3),乙腈初始比例对Ф影响不具有统计学意义(p=0.305 9>0.05);对HCRF影响显著的因素为线性梯度时间(p=0.003 4)和进样体积(p=0.044 0),乙腈初始比例对HCRF影响不具有统计学意义(p=0.106 6>0.05)。从Ф和HCRF的主效应图可以看出,三因素交互作用显著,进样体积(A)越大,图谱Ф和HCRF越高;而线性梯度时间(B)越长,对谱图分析越不利。见图1。
表4 Central Composite响应因子结果
根据方差分析响应曲面图所示,进样体积和线性梯度时间的交互影响是比较显著的。在进样体积不变的情况下,线性梯度时间越长,Ф和HCRF越小;而在线性梯度时间不变的情况下,随着进样体积的增加,Ф和HCRF增大。从HCRF响应曲面分析图可以看出,进样体积不变时,HCRF响应曲面曲率比Ф响应曲面曲率更大,说明线性梯度时间对HCRF(峰个数、分离度和性能)的影响更大。见图1。最后得到响应方程:
Ф=254.867+5.099×进样体积-0.945×线性梯度时间
HCRF=26 714 700+274 606×进样体积-107 952×线性梯度时间
注:A.Ф分离效果影响因素主效应图;B.Ф响应曲面分析图;C.HCRF分离效果影响因素主效应图;D.HCRF响应曲面分析图图1 分离效果影响因素主效应及响应曲面分析图
根据上述筛选结果,在设计水平范围内对响应因子做最大值计算。以3次重复试验验证因子分析结果,最终得到的色谱分析条件:色谱柱为Agilent 5 TC-C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);检测波长为280 nm;柱温为40 ℃;梯度时间为60 min;进样体积为20 μL;流速为1.0 mL·min-1;乙腈初始比例为3.5%;甲酸浓度为0.2%。
3.4 方法学验证
3.4.1 精密度试验 取同一批供试品溶液,连续进样6次,记录色谱图。对21个共有峰以均值法进行差异性评价,结果表明各共有峰保留时间RSD 为0.02%~0.24%,主要成分共有峰面积RSD 为0.72%~1.01%,符合指纹图谱的要求。
3.4.2 稳定性试验 取同一批供试品溶液,分别于制备后0、3、6、9、12、15、18、21、24 h进样,记录色谱图。共有峰以均值法进行评价,结果表明各共有峰保留时间RSD为0.02%~0.34%,主要成分共有峰面积RSD为 0.36%~1.52%,证明供试液在24 h内稳定。
3.4.3 重复性试验 取同一供试品5份,分别制备供试品溶液,进样,记录色谱图。结果表明,共有峰保留时间RSD为0.02%~0.33%,峰面积RSD为0.38%~2.91%,表明该方法重复性较好。
3.5 固肠止泻丸特征峰鉴定及不同批次制剂相似度评价
取10批固肠止泻丸及中间体,按2.1项下方法分别制备供试品溶液,进样,记录色谱图。通过与对照品混标图谱比较,确定8个特征峰,分别为咖啡酸、罂粟碱、延胡索乙素、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、6-姜辣素和异欧前胡素,见图2。
将10批固肠止泻丸及中间体的色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004年A版,进行相似度评价。结果表明,除1个批次外,其他批次制剂及中间体的指纹图谱相似度均>0.98。10批制剂及中间体的HPLC指纹图谱相似度结果见表5。
注:1.4.934 min;2.7.505 min;3.8.498 min;4.8.969 min;5.10.762 min;6.12.425 min;7.12.688 min;8.12.943 min;9.13.509 min;10.15.136 min,咖啡酸;11.16.150 min;12.19.559 min;13.21.751 min,盐酸罂粟碱;14.22.422 min,延胡索乙素;15.22.826 min;16.23.33 min,盐酸药根碱;17.28.858 min,盐酸巴马汀;18.29.768 min,盐酸小檗碱;19.33.207 min;20.61.028 min,6-姜辣素;21.64.607 min,异欧前胡素。图2 固肠止泻丸及中间体对照指纹图谱
批次(2014-)1201120212041205120611011103110411051106对照指纹图谱1201110.9990.9990.9990.3070.9810.9810.9810.9860.9851202110.9990.9990.9990.3080.9830.9840.9840.9880.98612040.9990.99910.9990.9990.3080.9770.9770.9770.9850.98312050.9990.9990.999110.3080.9810.9820.9820.9880.98612060.9990.9990.999110.3080.9810.9820.9810.9880.98611010.3070.3080.3080.3080.30810.3040.3040.3040.3070.43511030.9810.9830.9770.9810.9810.3041110.9970.98611040.9810.9840.9770.9820.9820.3041110.9970.98611050.9810.9840.9770.9820.9810.3041110.9970.98611060.9860.9880.9850.9880.9880.3070.9970.9970.99710.988对照指纹图谱0.9850.9860.9830.9860.9860.4350.9860.9860.9860.9881
4 结论
近几十年来,现代中药复方制剂被广泛用于疾病的预防与治疗,但药材中的活性成分非常复杂,使其应用受到限制[10-13]。目前已有应用高效液相色谱、质谱、核磁共振等分析技术对中药活性成分进行的大量研究,但是这些研究还不足以全面反映中药多成分的特点[14-15]。由于中药的治疗作用是基于多种成分互相作用而产生的,因此,其指纹色谱被认为是中药质量控制最有利的方法,而这种技术也成功地应用于中药制剂的质量控制中。相比于超高效液相色谱,高效液相色谱虽然分离效率较低,但对于成分复杂的中药体系而言,分离可操作性更加理想,更适于大范围的中药指纹图谱的检测。
本研究设计了“三步”开发固肠止泻丸HPLC指纹图谱的方法,通过优化液相分析中的影响因素,确定可控参数,得到有效的线性梯度洗脱法,最后进行方法验证以及指纹图谱共有峰的比对。本研究为固肠止泻丸的鉴定及质量控制提供新的手段,为中药色谱指纹图谱的分析提供新的思路。
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ApplicationofPlackett-Burman-CentralCompositeDesignforFingerprintAnalysisofGu-Chang-Zhi-XiepillbyHPLC-DADapproach
LIUYanru1,LYUYang1,SONGZhongxing1,ZHANGSuiling1,TANGZhishu1,LIULi1*,WANGXinghai2
(1.ShaanxiUniversityofChineseMedicine/ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,ShaanxiprovincekeylaboratoryofnewdrugsandChinesemedicinefoundationresearch,Xianyang712083,Shaanxi,China;2.ShaanxiChineseTraditionalMedicineAcademyPharmaceuticalFactory,Xianyang712083,Shaanxi,China;)
Objective:To identify and evaluate quality of Gu-Chang-Zhi-Xie pill (GCZX),APlackett-Burman-Central Composite Design with response surface analysis method was implemented to optimize and validate the chromatographic system of GCZX fingerprint.Methods:Firstly,the controllable factors were selected,design of experiments (DOEs) were performed for further optimization.Then,injection precision,repeatability,and sample stability test were performed.Results:A feasible and reliable HPLC-DAD system was established by using a acetonitrile-0.2% formic acid linear gradient elution with a column temperature of 30 ℃ and a detection wavelength of 280 nm.21 common peaks were found and 8 characteristic peaks were identified referred to reference substances.Conclusion:The strategy of optimization method can be applied for the development of fingerprints in the quality control of Gu-Chang-Zhi-Xie pill.
Gu-Chang-Zhi-Xie pill;design of experiment;HPLC-DAD;fingerprint
10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.017
2015-02-10)
陕西省科技统筹创新工程计划项目(2011KTCG03-02)
*
刘力,硕士生导师,研究方向:溃疡性结肠炎的发病机制与中医药治疗研究、脾胃病诊疗技术的标准化与临床疗效评价方法研究;Tel:(029)38185009,Email:liuyan791@163.com