牛蒡子炮制前后化学成分变化研究△

袁颖，冉小库，徐煜彬，窦德强

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

·基础研究·

牛蒡子炮制前后化学成分变化研究△

袁颖，冉小库，徐煜彬，窦德强*

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

目的：比较牛蒡子炮制前后色谱指纹图谱，对变化成分进行分离纯化，并进行结构鉴定，进一步对牛蒡子炮制机理进行探讨研究。方法：采用高效液相色谱法，建立牛蒡子的指纹图谱，揭示其炮制后成分变化规律，采用系列硅胶、反相硅胶柱色谱、高效液相色谱，对变化成分进行分离纯化，结合NMR波谱学数据，对化合物进行结构解析，确定其结构。结果：建立了牛蒡子生品与制品在296 nm波长下的指纹图谱，通过对比发现了两个非木脂素类变化成分。分离并鉴定了两个化合物，分别是3，5-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-二咖啡酰基奎宁酸，二者含量在炮制前后存在显著变化。结论：共分离得到两个酚酸类物质，并且二者为首次从牛蒡子果实中分离得到。通过研究发现，由于牛蒡子在炮制过程中受温度影响，其所含有的3，5-二咖啡酰基奎宁酸可向4，5-二咖啡酰基奎宁酸转化，从而使牛蒡子生品与制品在指纹图谱上出现较大差异，本研究可以为牛蒡子的炮制机理及质量标准研究提供一定的理论依据。

牛蒡子；炮制；咖啡酰基奎宁酸；化学成分

牛蒡子为菊科植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果实，属辛凉解表药，具疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽之功效。用于治疗风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛、痄腮、丹毒、痈肿疮毒等症[1]，又名恶实、鼠粘子、黍粘子、大力子等，在我国分布广泛，其中以浙江产“杜大力”和东北产“关大力”最为有名[2-3]。牛蒡子中主要含有木脂素类化合物，其中以牛蒡苷的含量最高，能达到药材的5%，现代药理研究表明牛蒡子具有抗病毒、抗菌、抗癌、抗糖尿病、免疫调节、利尿、抗氧化等作用[4-6]。牛蒡子中化学成分报道以木脂素类较多，而其他类成分鲜有报道。牛蒡子临床用药以炮制品居多，关于牛蒡子炮制的研究较多，但是炮制后化学成分变化情况并没有很好地得以解释，本研究通过结合中药化学提取分离技术及核磁共振波谱解析技术以及高效液相指纹图谱技术，对牛蒡子炮制后化学成分进行研究，以期为牛蒡子质量控制以及炮制机理提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪(四元泵、在线脱气、DAD检测器，美国安捷仑科技有限公司)；AE系列电子分析天平：FA-1004电子天平(上海精科天平厂)；METTLER AB135-S十万分之一电子天平(瑞士)。Burker-ARX-600型核磁共振光谱仪(德国Burker公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HITACHI LC-7100型高效液相色谱仪，UV-7400检测器(日本日立公司)，YMC-C18色谱柱(ODS)(日本YMC公司，25 cm×9.4 mm，5 μm)，Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(ODS)(美国Agilent公司，150 mm×4.6mm，5 μm)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；101型电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A(国家药典委员会)。

1.2 材料

甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)，甲酸(天津市凯信化学工业有限公司，优级纯)，水(娃哈哈纯净水)，其他试剂均为分析纯。

实验所用10批牛蒡子分别购自全国各药店，由辽宁中医药大学康廷国教授鉴定为ArctiumlappaL.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：甲醇(A)、0.25%磷酸水(B)，梯度洗脱，梯度程序见表1。流速：1 mL·min-1；检测波长：296 nm，进样体积：10 μL，所有组分色谱峰均在45 min内流出完毕。

表1 流动相梯度洗脱程序表

2.2 供试品溶液的制备

取不同产地牛蒡子生制牛蒡子粉末各5 g，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇约45 mL，超声处理(功率150 W，频率120 kHz)30 min，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 指纹图谱的建立

共采集不同产地10批牛蒡子生品与制品色谱图，将所得结果导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A(国家药典委员会)，得到公共指纹图谱。见图1～4。

图1 10批牛蒡子生品匹配前色谱图

图2 10批牛蒡子制品匹配前色谱图

图3 10批牛蒡子生品公共指纹图谱

图4 10批牛蒡子制品公共指纹图谱

2.4 结果

10批牛蒡子生品及制品的指纹图谱与各自公共指纹图谱相似度均在0.9以上，说明该方法稳定可靠。通过生品与制品公共指纹图谱的对比，发现在296 nm波长下，10号和12号色谱峰含量变化显著，其中10号峰物质含量明显下降，12号峰物质含量显著提高。牛蒡子中主要含牛蒡子苷等木脂素类成分，木脂素类成分的紫外吸收图如图5所示，而10、12号色谱峰的紫外吸收图经DAD检测器查看得图6，发现其并非为木脂素类成分，究竟为何物质，未曾有人揭示，因此笔者对10、12号峰进行了系统分离鉴定研究。

图5 牛蒡子中木脂素类成分紫外吸收图

图6 10、12号色谱峰紫外吸收图

2.5 色谱峰10和12的化学成分研究

2.5.1 提取和分离 干燥的制牛蒡子3 kg，粉碎成粗粉，8倍量乙醇回流提取2次，每次提取2 h，滤过，合并滤液，回收乙醇至无醇味，加水形成悬浮液，分别用等体积的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分取有机相，得石油醚浸膏72 g，三氯甲烷浸膏200 g，乙酸乙酯浸膏20 g，正丁醇浸膏 60 g。

取正丁醇浸膏用二氯甲烷-甲醇溶解，加入100～200目硅胶120 g拌匀，挥干溶剂。称取200～300目硅胶1000 g，加二氯甲烷浸泡，使其充分溶胀，装柱，待硅胶沉降完全，上样。以二氯甲烷-甲醇(100∶10～0∶100)进行梯度洗脱，每250 mL为1个流分，共收集50个流分。TLC检识，合并相似者。1～15合并为成分Ⅰ，16～28合并为成分Ⅱ，29～38合并为成分Ⅲ，39～42合并为成分Ⅳ，43～50合并为成分Ⅴ。

将成分Ⅱ经反相硅胶开放柱色谱分离，甲醇-水(20∶80，80∶20，100∶0)为洗脱剂洗脱，相同梯度洗脱液合并，共收集3部分，分别标记为Fr2-1，Fr2-2，Fr2-3。Fr2-2采用高效液相色谱法分离，以甲醇-0.05%甲酸水(46∶54)为流动相，320 nm波长下检识，得到纯品化合物1(30 mg)。

将成分Ⅲ经反相硅胶开放柱柱色谱分离，甲醇-水(20∶80，80∶20，100∶0)为洗脱剂洗脱，相同梯度洗脱液合并，共收集3部分，分别标记为Fr3-1，Fr3-2，Fr3-3。Fr3-2采用高效液相色谱法分离，以甲醇-0.05%甲酸水(43∶57)为流动相，320 nm波长下检识，得到纯品化合物2(35 mg)。

表2 3，5-二咖啡酰基奎宁酸核磁数据(13C 125 MHz，1H 500 MHz，CD3OD)

图7 3，5-二咖啡酰基奎宁酸(3，5-dicaffeoyl quinic acid)

图8 4，5-二咖啡酰基奎宁酸(4，5-dicaffeoyl quinic acid)

化合物2文献[7]序号δCδH序号δCδH175.90176.05238.422.23(2H,m)238.372.23(2H,m)369.034.37(1H,m)368.974.37(1H,m)475.905.11(1H,dd,8.5,3.0Hz)475.735.11(1H,dd,9.0,3.0Hz)569.515.63(1H,brs)569.345.61(1H,ddd,4.5,9.2,9.4Hz)639.522.30(1H,m)638.372.30(1H,m)2.10(1H,m)2.10(1H,dd,4.0,14.2Hz)7178.537176.801'127.731'127.70127.67127.642'115.217.01(1H,d,2.0Hz)2'115.197.01(1H,d,2.0Hz)116.417.00(1H,d,2.0Hz)115.197.00(1H,d,2.0Hz)3'146.753'146.73147.56146.734'149.644'149.64149.64149.645'116.496.74(1H,d,8.0Hz)5'116.476.74(1H,d,8.0Hz)116.496.73(1H,d,8.2Hz)116.476.73(1H,d,8.2Hz)6'123.126.90(1H,dd,2.0,8.0Hz)6'123.136.90(1H,dd,2.0,8.0Hz)123.126.90(1H,dd,2.0,8.0Hz)123.136.90(1H,dd,2.0,8.0Hz)7'147.697.59(1H,d,15.9Hz)7'147.407.59(1H,d,15.9Hz)147.567.51(1H,d,15.9Hz)7.51(1H,d,15.9Hz)8'114.756.28(1H,d,15.9Hz)8'114.736.28(1H,d,15.9Hz)114.786.18(1H,d,15.9Hz)6.18(1H,d,15.9Hz)9'168.569'168.55168.27168.22

2.5.3 色谱峰10和12的鉴定 将分离得到的化合物1和2取适量，加甲醇溶解，照2.1项下色谱条件，分别注入高效液相色谱仪，在色谱峰10和12保留时间处，分别出现相同色谱峰，且二者紫外吸收图与图6相同，故确定色谱峰10为3，5-二咖啡酰基奎宁酸，色谱峰12为4，5-二咖啡酰基奎宁酸，二者为牛蒡子炮制后在296 nm波长下主要变化成分。

3 讨论

通过建立牛蒡子生品与制品的指纹图谱，揭示了生品与制品化学成分变化规律，牛蒡子经炮制后，部分小色谱峰消失，同时增加部分小色谱峰，但是其含量很低。但在波长为296 nm下，笔者发现了两个非木脂素类成分，其含量变化显著，二者的紫外吸收光谱相同，且二者明显存在此消彼长的趋势。最终，笔者通过运用中药化学相关技术与方法，将二者分离开来，并运用波谱学方法，确定二者化合物的结构为咖啡酰基奎宁酸类化合物。同时经高效液相色谱法验证，指纹图谱中色谱峰10为3，5-二咖啡酰基奎宁酸，色谱峰12为4，5-二咖啡酰基奎宁酸。牛蒡子在炮制过程中，由于受温度影响，3，5-二咖啡酰基奎宁酸可以转化成立体结构更加稳定的4，5-二咖啡酰基奎宁酸。

咖啡酰基奎宁酸是一类由奎宁酸与数目不等的咖啡酸通过酯化反应缩合而成的酚酸类天然成分，广泛存在于植物界如金银花、旋覆花、苍耳等中药及茶叶、山楂等果树中。而这类植物往往与牛蒡子一样具有疏散风热、清热解毒的作用，其可能与植物中所含有的咖啡酰基奎宁酸或绿原酸等酚酸类成分有关，现代药理研究发现二咖啡酰基奎宁酸具有很好的抗氧化、抗炎、抗病毒、抗纤维化、抑制平滑肌收缩、降血脂等诸多作用[8]。笔者通过实验发现牛蒡子中含有一些二咖啡酰基奎宁酸类成分，其可能为牛蒡子疏散风热、解毒利咽的有效成分。通过本研究所得结论，可以为牛蒡子的质量标准以及炮制规范研究提供理论依据，为牛蒡子更好地应用于临床及新药开发奠定基础。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：66-67.

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Studies on Change of Chemical Constitunetsin Arctii Fructus after Processing

YUAN Ying，RAN Xiaoku，XU Yubin，DOU Deqiang*

(College of pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China)

Objective：To isolate and elucidate the altered constituents in Arctii Fructus after processing by comparing the variations of their fingerprints，and clarify the mechanism of processing.Methods：The fingerprints were established with HPLC，and a series of column chromatography were applied to obtain the compounds，and their structureswere elucidated by NMR.Results：Two phenolic acids were isolated and elucidated as 3，5-dicaffeoyl quinic acid，4，5-dicaffeoyl quinic acid，and their contents changed significantly after processing.Conclusion：Two phenolic acids were isolated，and both of them were isolated from this drug for the first time.and we also found that the 3，5-dicaffeoyl quinic acid can transform to 4，5-dicaffeoyl quinic acid，during the processing procedure，it may be caused by heat，and the spatial conformation of 4，5-dicaffeoyl quinic acid may be much more stable than 3，5-dicaffeoyl quinic acid，this research can provide theory evidence for the mechanism of processing.

Arctii Fructus；processing；caffeoylquinic acid；chemical components

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.8.007

2015-01-30)

辽宁省高等学校创新团队课题(LT2013020)

*

窦德强，教授，研究方向：中药药效物质基础及新药开发；Tel：(0411)85890143，E-mail：deqiangdou@126.com