不同粉体二妙丸HPLC指纹图谱对比研究△

肖娟，蔡萍，万丹，张水寒

(湖南省中医药研究院，湖南省中药粉体与创新药物省部共建重点实验室，湖南 长沙 410006)

·中药工业·

不同粉体二妙丸HPLC指纹图谱对比研究△

肖娟，蔡萍，万丹，张水寒*

(湖南省中医药研究院，湖南省中药粉体与创新药物省部共建重点实验室，湖南 长沙410006)

目的：分别建立超微粉和细粉二妙丸的HPLC指纹图谱，并对其进行对比研究。方法：采用HPLC对不同粉体形态制备的二妙丸建立指纹图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”建立标准指纹图谱，对不同粉体二妙丸的指纹图谱进行相似度分析。结果：方法的精密度、重复性及稳定性良好。两种不同粉体形态制备的二妙丸指纹图谱的相似度均大于0.91，两者在共有峰上没明显差别，而峰面积差别明显。结论：该方法稳定准确，建立的HPLC指纹图谱能从整体上反映出二妙丸的化学成分信息，为建立二妙丸质量标准提供参考。

二妙丸；HPLC指纹图谱；超微粉

二妙丸是《中华人民共和国药典》2010版收载的经典名方，由苍术和黄柏两味药组成。苍术辛温发散、苦燥除湿；黄柏苦寒、清热燥湿，两者相使配伍使用，具有较强的清热燥湿功能。临床上主要用于足膝红肿热痛、下肢丹毒、白带、阴囊湿痒等病症[1-2]。近年来超微粉碎技术在中药制剂领域应用越来越广泛，与传统粉碎技术相比，其可将中药材粉碎成微米级甚至纳米级。显著提高药材细胞壁的破碎率，药粉颗粒大小分布更均匀，比表面积高，球性度及均质度更好，能更快地促进细胞内有效成分的溶出、释放和吸收[3-5]，提高了中药成分的利用效率，减少浪费。有文献报道[6]，超微粉碎技术制备的二妙丸功能显著优于普通细粉二妙丸。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，通过指纹特征相似程度的比较来判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性。目前中药指纹图谱已经成功用于中成药生产过程中，可对中成药的质量进行控制，是符合中药特色的质量控制模式之一[7]。本研究通过分别建立超微粉和细粉二妙丸HPLC指纹图谱，对其进行对比研究，以探索HPLC指纹图谱能否全面反映出其化学成分信息以及两者的差异，为二妙丸质量标准控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器

BFM-T6BI“贝利”微粉机(济南贝利粉碎技术工程有限公司)；Winner3001干粉激光粒径仪(济南微纳仪器有限公司)；柴田式粉碎机(天津市渤海鑫茂制药设备有限公司)；可倾式多功能制丸机(DZ-20，温岭市林大机械有限公司)；高效液相色谱仪(SHIMADZ-LC-20A，日本岛津)；T-214电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2试药

盐酸小檗碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110713-200208)；甲醇(分析纯)；甲醇(色谱级)；醋酸(色谱级)；怡宝蒸馏水；其他试剂均为分析级。

1.3材料

苍术、黄柏药材经湖南中医药研究院中药鉴定室鉴定为正品，按《中华人民共和国药典》2010版定性定量检测，符合规定；细粉、超微二妙丸均为实验室自制，经检测符合中华人民共和国药典要求。

细粉二妙丸制剂工艺：取处方比例的苍术和黄柏混合，采用柴田式粉碎机粉碎，过5号筛，得药材细粉，混匀，在可倾式多功能制丸机中用水泛丸，70℃干燥，灭菌即得。

超微粉二妙丸最佳制剂工艺：取处方比例的苍术和黄柏混合，采用贝利粉碎机粉碎，药材干燥至水分5%以下，介质填充率60%～70%，振幅为5mm，粉碎温度为1～15℃，粉碎时间为20min。采用Winner3001干粉激光粒径仪测得粉体粒径的D90<75μm(90%粒径值)，得超微粉，混匀，在可倾式多功能制丸机中用水泛丸，70℃干燥，灭菌即得。

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：InertsilODS-2(GLSciencesInc，250mm×4.6mm，5μm)；流动相：1%的醋酸水溶液(A)，1%的醋酸甲醇溶液(B)，梯度洗脱，0～10min15%～25%B，10～30min25%～55%B，30～50min55%～85%B，50～60min85%～100%B；检测波长：305nm；柱温：35℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL。

2.2对照品溶液的制备

取盐酸小檗碱适量，精密称定，置于10mL的量瓶中，加甲醇制成质量浓度为0.1mg·mL-1的对照品溶液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，备用。

2.3供试品的制备

2.3.1细粉二妙丸供试品的制备 取10批细粉二妙丸适量，研细，取粉末6.0g，精密称定，置于索氏提取器中。精密加入乙醚100mL，35℃水浴回流2.5h，弃去乙醚液，残渣挥去乙醚，加95%乙醇60mL，加热回流提取1h，过滤。残渣加50%乙醇60mL，回流提取两次，过滤，合并提取液，浓缩至20mL，用60%乙醇定容至25mL，摇匀，作为供试液。进样前用0.45μm微孔滤膜滤过，得细粉二妙丸供试品。

2.3.2超微粉二妙丸供试品的制备 取10批超微粉二妙丸适量，研细，取粉末6.0g，精密称定，余下处理与2.3.1项下相同，得超微粉二妙丸供试品。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验 取同一供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样5次，记录指纹图谱。以参照峰为对照峰计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果RSD<2.0%，相似度均大于0.96，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10μL，按2.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、8h测定，记录指纹图谱。以参照峰为对照峰计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果RSD<2.0%，相似度均大于0.95，符合指纹图谱要求，表明8h内样品稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批次超微粉妙丸5份，按2.3.1项下方法制备供试品溶液，进样分析，记录指纹图谱。以参照峰为对照峰计算主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果RSD<2.0%，相似度均大于0.95，符合指纹图谱要求，表明方法重复性良好。

2.5指纹图谱的建立及分析

2.5.1参照峰的选择 盐酸小檗碱是黄柏中的活性成分，含量较高且保留时间恰当，也是黄柏质量控制的指标成分，故选用盐酸小檗碱作为指纹图谱的参照峰。按2.1项下色谱条件进样10μL，记录色谱图，见图1。

图1 盐酸小檗碱对照品液相图

2.5.2 指纹图谱数据的采集 分别取不同粉体二妙丸的供试品，按照2.1项下的色谱条件得到细粉和超微粉二妙丸的指纹图谱。以盐酸小檗碱为参照峰，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”分别对他们的共有色谱峰相对保留时间和相对峰面积进行统计。

2.5.3 共有峰的标定 对10批样品的图谱进行分析比较，计算不同批次各妙丸供试品色谱图中共有峰占总面积的百分比。结果表明，共有峰面积占总面积平均为90%以上，符合指纹图谱的要求。

2.5.4 指纹图谱共有模式的建立及相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”

分别对各妙丸进行相似度分析。以细粉二妙丸为例，以盐酸小檗碱峰为参照峰，以S5为参照图谱，经过多点校正，自动匹配，采用中位数法生成对照图谱，见图2。标示了细粉和超微粉二妙丸指纹图谱中15个共有峰，其中7号峰为盐酸小檗碱峰，见图3～4。

2.5.5 相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”分别对细粉和超微粉二妙丸指纹图谱进行相似度分析，10批超微粉二妙丸与对照图谱的相似度分别为0.945、0.938、0.935、0.917、0.925、0.934、0.928、0.956、0.945、0.956；10批细粉二妙丸与对照图谱的相似度分别为0.928、0.935、0.926、0.913、0.929、0.932、0.933、0.956、0.943、0.911，均大于0.91，均符合指纹图谱要求。

图2 二妙丸典型的HPLC指纹图谱

图3 10批细粉二妙丸的HPLC指纹图谱

图4 10批超微粉二妙丸的HPLC指纹图

可见二妙丸的指纹图谱可以从整体反应出其化学成分信息，可为二妙丸质量标准提供参考。此外，两种不同粉体二妙丸在共有峰方面没有显著差别，但在共有峰的峰面积上，超微粉妙丸的共有峰峰面积要大于细粉妙丸，见表1。说明药粉经超微粉碎后，粉体粒径减小，比表面积增大，与提取溶媒的接触面积增加，相同的提取时间内提取效率提高，有效成分溶出量增加，这也反映出超微技术在传统丸剂制备中的优势。

表1 不同批次细粉、超微二妙丸共有峰峰面积均值及相应比值

注：S1为10批细粉二妙丸各共有峰峰面积均值；S2为10批超微粉二妙丸各共有峰峰面积均值。

3 讨论

本试验通过对两种不同粉体的二妙丸进行HPLC指纹图谱研究，对共有峰进行指认，建立其共有模式，为建立二妙丸质量标准提供参考。同时超微粉妙丸的提取效率要优于细粉妙丸，后续的溶出度试验表明，超微粉妙丸的溶出度也显著优于细粉妙丸。

二妙丸检测波长的选择是通过高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)检测，在2.1色谱条件下，绘出各波长三维色谱图，选择色谱峰信息完整、分离度好、基线平稳、干扰最少的检测波长；采用单因素法对二妙丸的提取方法进行考察，回流提取效率更高；虽然苍术中的挥发油是其有效成分，但是通过乙醚除去挥发油使得指纹图谱的色谱峰的分离度更好，检测基线更平稳，确定采用2.3项下提取方法；此外还对流动相及色谱柱进行了优选。

本试验成功建立了两种粉体状态的二妙丸HPLC指纹图谱，为建立二妙丸质量标准提供了参考。对其全面质量控制还需要采用高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(HPLC-Q/TOF-MS)进行定性和高效液相色谱串联三重四级杆质谱(HPLC-QqQ-MS)进行定量相结合的研究，发现其等效部位群[8]，最终建成宏观和微观相结合的质量评价方式，确保二妙丸在临床上的有效性，这是今后研究工作的方向。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2] 梁汝庆，郑桂芝，孔祥亮.二妙散到四妙丸的用药规律初探[J].中医药学刊，2004，22(12)：2337-2338.

[3] 李跃辉，肖娟，张水寒，等.超微粉碎技术对苍术粉体理化性质的影响[J].中国医药科学，2012，2(17)：11-13.

[4] 金万勤，黄芳，郭立玮.苍术、黄柏及二妙丸超细微粉的生物药剂学的研究Ⅰ.扫描电子显微镜技术对超细微粉的表征[J].中草药，2001，32(4)：306-308.

[5] 袁清照，张水寒，蔡光先.超微粉碎技术在枳术丸中的应用及溶出影响研究 [J].中国实验方剂学杂志，2009，15(9)：10-13.

[6] 黄芳，郭立玮，袁红宇，等.超细粉体技术对二妙丸体内吸收、分布的影响[J].南京中医药大学学报(自然科学版)，2007，18(4)：216-218.

[7] 白瑞，王真真.指纹图谱在中药质量控制中的应用进展[J].安徽医药，2009，13(12)：1458-1462.

[8] Peng Liu，Hua Yang，Fang Long，et al.Bioactive Equivalence of Combinatorial Components Identified in Screening of an Herbal Medicine[J].Pharm Res，2014，31(7)：1788-1800.

HPLCFingerprintStudyonUltra-microandNormalpowderofErMiaoPill

XIAOJuan，CAIPing，WANDan，ZHANGShuihan*

(HunanAcademyofChineseMedicineHunanChineseMedicinePowderandInnovationDrugProvinceDepartmentCoconstructionandKeyLaboratories，MinistryofEducation，Changsha410006，China)

Objective：To establish HPLC fingerprint of Ultra-micro and Normal powder of Er Miao Pill respectively and compare the fingerprints.Methods：The fingerprint of Ultra-micro and normal powder of Er Miao Pill was acquired by HPLC.The HPLC chromatograms were analyzed by the similarity calculation software.Results：The results of methodological study met technical requirements of HPLC fingerprint.The similarities of the ultra-micro and normal powder of Er Miao Pill exceeded0.91，The HPLC fingerprints of ultra-micro and normal powder of Er Miao Pill had obvious differences in area of common peaks but less differences in number of common peaks.Conclusion：The HPLC fingerprint method was stable and accurate and could reflect the whole chemical composition information and provide a basis for the establishment of quality standard for Er Miao pill.

Er Miao Pill；HPLC fingerprint；ultra-micro powder

湖南省战略性新兴产业科技攻关与重大科技成果转化项目(2012GK4103)

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张水寒，教授，博士生导师，研究方向：中药资源、制剂及质量标准研究；E-mail：zhangshuihan0220@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.025

2015-04-22)