基于组分结构理论探讨亳菊花硫磺熏蒸前后化学成分组成结构差异

陈建衡

(山东省泰山疗养院 药剂科，山东 泰安 271000)

·基础研究·

基于组分结构理论探讨亳菊花硫磺熏蒸前后化学成分组成结构差异

陈建衡*

(山东省泰山疗养院 药剂科，山东 泰安 271000)

目的：研究亳菊花硫磺熏蒸前后化学成分组成结构差异，并讨论硫磺熏蒸对亳菊花质量的影响。方法：建立硫磺熏蒸前后亳菊花的化学成分指纹图谱，采用HPLC-DAD色谱法测定亳菊花中主要活性成分绿原酸和木犀草素在硫磺熏蒸前后的含量变化。ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脱，流速：1.0 mL·min-1，检测波长：324 nm(绿原酸)和348 nm(木犀草素)，柱温25 ℃。结果：经硫磺熏蒸过后的亳菊花中2、4、7、8、9、10号指纹峰所代表的成分含量均有不同程度的下降；亳菊花经硫磺熏蒸过后，绿原酸含量平均值由(3.68 ± 0.06)g·kg-1增加为(4.91 ± 0.01)g·kg-1(P<0.01)，木犀草素含量平均值无显著变化。结论：亳菊花经过硫磺熏蒸后，亳菊花原有的化学成分组成结构发生了改变，这一变化将影响到硫熏亳菊花的安全性和有效性，因此对其临床使用有待进一步研究。

亳菊花；硫磺熏蒸；绿原酸；木犀草素；化学成分组成结构差异

硫磺熏蒸法虽然能实现防腐、防霉、防虫蛀、有利于干燥和增色[1]，但是硫磺熏蒸存在的问题日益受到关注，并存在对硫磺熏蒸法是摒弃还是传承的质疑[2]，硫磺熏蒸对中药材品质具有一定程度的负面影响[3]。2013年，国家中医药行业科研专项“中药材硫磺熏蒸替代技术及规范化研究”项目也已经顺利启动[4]。亳菊花ChrysanthemummorifoliumRamat.为菊科菊属植物，味甘、苦，微寒，归肺、肝经，具有疏散风热，平肝明目，清热解毒之功效。用于治疗风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛等症[5]。研究表明，亳菊花具有抗菌、抗病毒、抗炎、扩张冠状动脉、降低血压、预防高血脂、抗衰老等活性[6-9]。已有研究表明，硫熏过程多采用工业硫磺，会残留大量的二氧化硫并影响到亳菊花中主要成分的变化，人体食用硫磺熏蒸过的中药材会刺激呼吸道黏膜，引起气管炎、支气管炎等呼吸道疾病和肝脏损伤，实验小鼠吸入二氧化硫或食用二氧化硫衍生物可导致神经系统DNA损伤[10]。但是，硫熏亳菊花(毒亳菊花)的报道屡见不鲜，影响到亳菊花的用药安全性和有效性[4]。我们前期研究表明，经过硫磺熏蒸后，亳菊花中的铜、铅、砷等有害元素的含量会呈现不同程度的升高[11]。此外，硫磺熏蒸也会使得亳菊花中部分活性成分发生变化[12]。本研究系统阐述了亳菊花硫磺熏蒸前后其化学成分的含量变化和化学成分组成结构差异。

1 仪器与试药

1.1仪器

Agilent1200高效液相色谱仪，配备Agilent1200色谱工作站和DAD二极管阵列检测器(美国Agilent公司)；METTLERAL204十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2试药

升华硫(国药集团化学试剂有限公司，批号：20121211)，绿原酸对照品(批号：110753-200413)和木犀草素对照品(批号：111520-200504)购自中国食品药品检定研究院，甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

阴性亳菊花由亳州市辉睿中药科技有限公司提供，经南京中医药大学中药鉴定教研室吴德康教授鉴定为菊科菊属植物菊，阳性亳菊花由实验室用阴性亳菊花经过硫磺熏蒸自制。

2 方法与结果

2.1硫熏亳菊花的制备

称取阴性亳菊花适量于干燥器中，以适量水润湿30min，取10%药量的升华硫，点燃，置于同一干燥器中，以凡士林涂抹盖口密闭容器，持续熏蒸24h。取出，置45℃烘箱内12h，待烘干后粉碎，待用。

2.2色谱条件

ZORBAXSB-C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脱(0～8min，2%A；8～10min，2%～7%A；10～20min，7%～47%A；20～30min，47%～60%A；30～40min，60%～70%A)；体积流量：1.0mL·min-1；检测波长：324nm(绿原酸)和348nm(木犀草素)；柱温：25℃。

2.3供试品溶液的制备

取阴性、阳性亳菊花，打粉处理(60目筛)，各取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定质量，超声提取(功率250W，频率25kHz)30min，放冷，称定质量，以50%甲醇补足失重，摇匀，离心，作为供试品溶液。

2.4指纹图谱的建立

2.4.1指纹图谱的构建 取5份阴性供试品溶液与3份阳性供试品溶液，分别进样40μL，按上述色谱条件进行分析，选取324nm检测波长下的8份样品的高效液相色谱图进行叠加，作为定性鉴别的参考谱图[13-14]，见图1。

2.4.2共有指纹峰的标定 采用相对保留时间标定共有指纹峰，以图谱中绿原酸(3号指纹峰)色谱峰为参照峰，将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照峰的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间，计算8批样品指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间，分别为0.873(1号指纹峰)、0.966(2号指纹峰)、1.000(3号指纹峰)、1.043(4号指纹峰)、1.195(5号指纹峰)、1.208(6号指纹峰)、1.265(7号指纹峰)、1.304(8号指纹峰)、1.561(9号指纹峰)、1.711(10号指纹峰)。选取其中各样品所共有的10个峰面积较大且分离度较好的色谱峰，标定它们为共有指纹峰。

2.4.3共有峰的相对峰面积 以图谱中绿原酸(3号指纹峰)色谱峰为参照峰，将各色谱峰峰面积与同一图谱参照峰的峰面积比较，其比值为各色谱峰的相对峰面积。见表1。

2.4.4非共有峰峰面积 计算非共有峰占总峰面积的比值。结果表明，其比值小于5%，符合指纹图谱的要求。

2.5线性关系考察

精密吸取绿原酸、木犀草素对照品母液，分别加甲醇制成2、4、6、8、10、50μg·mL-1质量浓度的对照品溶液，摇匀，作为对照品溶液，分别精密进样40μL，按2.2中色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，进行线性回归，绿原酸回归方程为Y=56.56X-9.90，r=0.999 8，木犀草素回归方程为Y=61.71X-10.55，r=0.999 9，表明绿原酸和木犀草素在2.0～50.0 μg·mL-1具有良好的线性关系。

注：S1～S3.硫磺熏蒸后的亳菊花HPLC图谱；S4～S6.硫磺熏蒸前的亳菊花HPLC图谱；S7～S8.硫磺熏蒸前的亳菊花加标HPLC图谱；3号峰为绿原酸；9号峰为木犀草素。图1 亳菊花样品HPLC指纹图谱

编号相对峰面积12345678910S10.0400.1011.0000.1622.9982.0330.6180.4930.5341.137S20.0430.0981.0000.1673.0272.0760.6180.4940.5220.942S30.0400.0951.0000.1673.0072.0820.6210.4900.5230.929S40.3280.2081.0000.1993.1052.0880.8850.8230.6151.408S50.3230.2291.0000.1893.1272.2090.9740.8700.5901.368S60.3270.2271.0000.1933.1172.2190.9790.8720.6141.327S70.2630.1771.0000.1522.5121.7310.7390.6970.5201.148S80.2590.2041.0000.2362.3511.6850.7450.6860.4871.081

2.6方法学考察

2.6.1精密度试验 取绿原酸和木犀草素对照品溶液各200μL加入600μL甲醇制成混合对照品溶液，按上述色谱条件下连续进样6次，结果绿原酸和木犀草素峰面积的RSD分别为1.17%和1.86%。

2.6.2重现性试验 取供试样品6份，制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，计算绿原酸、木犀草素质量分数。结果表明，样品中绿原酸、木犀草素质量分数的RSD分别为2.16%和2.07%。

2.6.3回收率试验 精密称取样品粉末0.1g，并分别按0.5倍、1.0倍和1.5倍加对照品，用50%甲醇分别定容至50mL，超声提取30min，放冷，补足失量，离心，分别进样40μL，按上述色谱条件测定绿原酸和木犀草素的含量，计算加样回收率。结果，木犀草素的回收率在81.05%～92.64%，绿原酸的回收率在100.52%～111.87%，见表2。

表2 加样回收率试验(n =3)

2.7样品测定

取阴性和阳性样品各3份，制备供试品溶液，进样40μL，按上述色谱条件测定，计算样品中的绿原酸和木犀草素含量，结果见表3。

表3 亳菊花经硫磺熏蒸前后绿原酸和木犀草素含量变化 /g·kg-1

注：与亳菊花(非硫熏)组相比，*P<0.01。

3 讨论

3.1亳菊花样品指纹图谱数据分析

本实验对3份阴性亳菊花样品、3份阳性亳菊花样品以及2份阴性加标亳菊花样品进行HPLC图谱分析，进而初步建立了亳菊花样品的指纹图谱，目的是为了定性地检测亳菊花经过硫磺熏蒸过后成分的种类和数量的变化情况。S1～S3谱图为阳性亳菊花样品，S4～S6为阴性亳菊花样品，S7～S8为阴性加标亳菊花样品。从指纹图谱上可以较为直观地观察到，阳性亳菊花样品HPLC谱图中的1号指纹峰相比于阴性亳菊花样品几乎消失，从数据上看，其相对峰面积也大幅度下降，这说明此成分的含量在亳菊花经过硫磺熏蒸过后会大幅下降；同样，综合指纹图谱和相对峰面积数据可以知道，经硫磺熏蒸过后的亳菊花中2、4、7、8、9、10号指纹峰所代表的成分含量均有不同程度的下降，这也表明了硫磺熏蒸会引起亳菊花中的部分成分含量下降，进而可能影响药效。这一现象可能是硫磺熏蒸中药存在的共性问题[12]。

3.2绿原酸、木犀草素含量分析

SPSS16.0软件被用于亳菊花硫磺熏蒸前后绿原酸和木犀草素的含量差异性分析，结果见表4。数据显示，亳菊花经硫磺熏蒸过后，绿原酸含量平均值由3.68g·kg-1增加为4.91g·kg-1，含量上升较为明显(P<0.01)；木犀草素含量平均值由3.75g·kg-1增加为3.81g·kg-1，含量上升不明显。我们推测，硫熏亳菊花中绿原酸含量的增加，可能是某些未知有机酸类成分在硫熏过程中转化成了绿原酸。

绿原酸是亳菊花中的主要成分，硫磺熏蒸后其含量显著增加，并不能说明硫熏过程能够增强亳菊花药效。因为，中药发挥最佳药效作用的物质基础是其所具有的独特的化学成分组成结构，某一种成分的含量高低并不是主要原因[15]。亳菊花经过硫磺熏蒸，虽然绿原酸的含量有所升高，但其中2、4、7、8、9、10号指纹峰所代表的成分含量均有不同程度的下降。因此，硫磺熏蒸改变了亳菊花的化学成分组成结构，很有可能极大地降低了亳菊花的药效。

3.3化学成分组成结构差异性

亳菊花经过硫磺熏蒸后，亳菊花中的化学成分组成结构发生了较大变化，不仅伴随着某些成分的含量降低(如2、4、7、8、9、10号指纹峰)，也有某些成分的含量增加(如绿原酸)，还有某些成分的含量无显著变化(如木犀草素)。因此，亳菊花经过硫磺熏蒸后，虽然没有产生新的化合物，但是亳菊花原有的化学成分组成结构发生了改变。综上所述，我们认为亳菊花经硫磺熏蒸后，其原有的药理作用也随之变化，甚至可能产生一定的毒副作用。我们也将进一步研究亳菊花硫磺熏蒸前后的药理活性的差异。

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StudiesonDifferenceofChemicalCompositionandStructureofChrysanthemumpreandpostSulfurFumigation

CHENJianheng*

(ShandongProvinceTaishanSanatoriumPharmacy，Taian271000，China)

Objective：To describe the difference of chemical composition and structure of Chrysanthemum pre and post sulfur fumigation，and discuss the influence of sulfur fumigation on the quality of Chrysanthemum.Methods： The determination was carried out by HPLC-DAD method with a ZORBAX SB-C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm)，eluted with the mobile phase of methanol(solvent A)-0.3% phosphoric acid(solvent B)(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The temperature of column was 25 ℃. The detection wavelength for chlorogenic acid and luteolin were 324 nm and 348 nm，respectively. Fingerprint of chemical composition of Chrysanthemum pre and post sulfur fumigation was established and the content changes of main active component were determined.Results： After sulfur fumigation，component content represented by fingerprint peaks of 2，4，7，8，9，10 all decreased to some extent，the average content of chlorogenic acid increased from (3.68± 0.06) g·kg-1to(4.91±0.01) g·kg-1，while there was no significant change in luteolin.Conclusion：The original chemical composition and structure of Chrysanthemum changed. This change will affect its safety and effectiveness. Therefore，the further study of its clinical use should be continued.

Chrysanthemum；sulfur fumigation；chlorogenic acid；luteolin；difference of chemical composition and structure.

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陈建衡，主管中药师，E-mail：jiangjuntcm2007@hotmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.011

2015-04-08)