山豆根抑制丁酰胆碱酯酶活性及活性部位UPLC-Q-TOF-MS分析△

王增绘，王冬梅，刘艾琳，黄林芳*

(1.中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193；2.中国医学科学院 药物研究所，北京 100050)

·基础研究·

山豆根抑制丁酰胆碱酯酶活性及活性部位UPLC-Q-TOF-MS分析△

王增绘1，王冬梅1，刘艾琳2，黄林芳1*

(1.中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193；2.中国医学科学院 药物研究所，北京 100050)

目的：应用高通量药物筛选技术发现山豆根乙醇提取物具有较强的抑制丁酰胆碱酯酶(BuChE)活性。采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)对其活性部位组分进行分析和鉴定。方法：药材经石油醚渗滤、乙醇提取、乙酸乙酯萃取和水煎煮后，得到4个提取部位。采用5，5′-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)法检测BuChE活性，并应用UPLC-Q-TOF-MS对其活性部位组分进行分析和鉴定。结果：山豆根的乙醇部位显示较强的BuChE抑制活性，并从其活性部位中分析鉴定了9个化合物，其中7个化合物主要成分为苦参碱类生物碱，属于喹诺里西啶类生物碱，分别是槐醇、苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、9a-羟基苦参碱、14β-羟基氧化苦参碱、Lamprolobine；2个黄酮类成分分别是Kushenol O、Kushenol I/N。山豆根乙醇提取部位IC50为15.169 μg·mL-1。结论：首次发现山豆根乙醇提取部位具有较强的BuChE抑制活性，其主要化学成分为苦参碱类生物碱，研究表明山豆根具有延缓老年痴呆的作用，为研发延缓老年痴呆新药提供科学依据。

丁酰胆碱酯酶抑制剂；高通量筛选；山豆根；提取物；有效成分；UPLC-Q-TOF-MS

山豆根是豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根及根茎，味苦，性寒，具有清热解毒、消肿利咽的功能[1]，主产于广西西南部至西北部，广东、云南和贵州也有少量分布。山豆根为《中华人民共和国药典》收载的常用中药，其化学成分主要为喹诺里西啶类生物碱及黄酮类。从山豆根中分离得到的该类生物碱主要分属于苦参型、金雀花碱型、奥豆碱型(鹰爪豆碱型)和羽扇豆碱型等4种类型[2]，主要有苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱、金雀花碱等一系列生物碱类化合物。黄酮类化合物主要以二氢黄酮类化合物最为丰富。现代药理研究表明，山豆根具有抗炎、抗肿瘤、镇痛、镇咳、杀菌、保肝、增强免疫、抗心律失常、降血压等广泛的药理活性[3]。本实验首次报道山豆根具有抑制丁酰胆碱酯酶(BuChE)活性、延缓老年痴呆的作用。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，即老年痴呆症，是常见的老年慢性退行性神经疾病。根据其公认的病理-胆碱能学说[4-7]，运用胆碱酯酶抑制剂来提高AD患者的乙酰胆碱水平，是目前唯一被普遍认可的药物治疗手段。临床上应用乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂，外周副作用较大，长期治疗效果不理想。新近研究表明，给予大鼠大脑皮层内灌注选择性BuChE抑制剂可使细胞外丁酰胆碱浓度增加15倍，且未发现胆碱样副作用。临床试验也表明，脑脊液中BuChE抑制与AD患者的认知功能具有相关性[11]。近年来，对丁酰胆碱酯酶进行抑制已成为新的AD治疗手段[8-9]。

本实验应用DTNB法[10]建立了BuChE抑制剂高通量筛选方法，对山豆根提取物进行了BuChE抑制活性筛选，研究首次发现，山豆根具有较强的BuChE抑制活性，并对其有效部位进行超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)分析。本实验为其进一步跟踪分离获得活性先导化合物奠定基础，也为临床治疗AD提供新的用药依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

POLARstargalaxy微板光学测定仪(BMG，Ger-many)；Personal Pipettor PP-550MS移液器(Apricot Designs，USA)；美国Waters AcquityTMUPLC/Q-TOF Premier；MassL-ynxV4.1工作站；实验室ELGA PURELAB Classic-UVF纯水机(英国)。

1.2 材料

氯化丁酰巯基胆碱(BuSCh)、四异丙基甲基焦磷酰胺(iso-oMPA)和5，5′-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)(Sigma公司)；人血浆(北京市红十字血液中心)；甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；超纯水。其他试剂均为市售国产分析纯。

山豆根于2011年9月购买于四川新荷花有限公司，药材样品经中国医学科学院药用植物研究所鉴定中心林余霖教授鉴定为豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根及根茎。

2 方法

2.1 待测样品的制备

药材样品粉碎成粗粉，取粗粉500 g，先用石油醚浸泡1 d后渗滤提取至提取液颜色浅(或5倍药材量)，回收石油醚，得石油醚提取物；残渣挥去石油醚，用80%乙醇湿润后再用3倍量80%乙醇回流提取两次，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，用等体积乙酸乙酯(EtOAc)萃取2次，合并EtOAc萃取液(上层)，浓缩至干，得EtOAc萃取物；母液浓缩至干(下层)，得乙醇提取物；残渣挥干乙醇，用3倍量水煮提2次，合并水提取液，浓缩至干，得水提取物。

2.2 活性测定方法

2.2.1 酶反应液、底物浓度、DTNB试液浓度的确定人血浆可直接作为酶源。本实验以0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液稀释人血浆80倍的稀释液作为酶反应液；筛选体系中选用3 mmol·L-1作为底物的终浓度，以保证较快的反应速度，实现高通量；确定DTNB试液的浓度为0.625 mmol·L-1，终浓度为0.25 mmol·L-1。

2.2.2 BuChE活性测定方法 采用改良的DTNB法[11]测定酶活性。BuChE水解丁酰胆碱生成胆碱及丁酸，胆碱可以与巯基显色剂DTNB反应生成TNB黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可以反映胆碱酯酶的活力。

氯化丁酰巯基胆碱(BuSCh)和5，5′-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)试剂均以0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液配制。氯化丁酰巯基胆碱试剂及酶反应液均临用现配。化合物大规模筛选在384孔板中进行，用PP-550MS移液器转移液体，每孔中含有终浓度为50 μg·mL-1的天然提取物5 μL，酶反应液20 μL，BuSCh试液20 μL，DTNB试液20 μL，反应总体积55 μL。用0.05 mol·μL-1磷酸盐缓冲液来代替样品，作为标准孔，反映酶的最大活性；以0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液代替样品及底物作为空白对照；以BuChE的特异性抑制剂四异丙基甲基焦磷酰胺(iso-OMPA)作为阳性对照，以检验方法的可靠性。

由移液器依次加入样品、酶反应液、DTNB试液，最后加入底物以启动反应，充分混匀，37 ℃孵育60 min后，送入POLAR star galaxy微板光学测定仪，读取412 nm吸收度值(A)。以吸收度值的变化斜率作为相对酶活性。抑制率计算公式：抑制率/%=(A标准-A样品)/(A标准-A空白)×100。

2.2.3 样品筛选 计算抑制率后对山豆根提取物样品进行复筛。复筛时每个样品依次稀释为5个浓度，实验重复3次，分别为50、5、0.5、0.05、0.005 μg·mL-1。根据测定结果计算半数最大抑制浓度(IC50)值。

2.3 活性成分测定方法

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18Column(50 mm×2.1 mm，，1.7 μm)；流动相：水溶液(A)、甲醇(B)；梯度洗脱：0 min(90% B)→2 min(85% B)→3 min(75% B)→4 min(70% B)→5 min(78% B)→6 min(60% B)→7 min(90% B)→8 min(90% B)；流速：0.3 mL·min-1；进样量：4 μL；柱温：30 ℃。

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，采用正离子V模式检测；脱溶剂气流量为800 L·h-1，脱溶剂气温为450 ℃，锥孔气流量为50 L·h-1，离子源温度为120 ℃，毛细管电压为3 kV，锥孔电压为40 V。0.1 s(间隔0.02 s)采集1次谱图。

2.4 山豆根乙醇溶液的制备

取已制得的山豆根乙醇提取物20.01 mg精密称定，置于25 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，备用。

3 结果

山豆根4个部位具有不同程度的BuChE抑制活性，结果见表1。而其乙醇部位抑制活性最强，在终浓度为50 μg·mL-1时，抑制率为79.18%，IC50为15.169 μg·mL-1，其他3个部位均小于该值。

表1 山豆根不同部位的BuChE抑制率和IC50值

按2.3.1分析条件，绘制山豆根乙醇溶液的UPLC-PDA图、UPLC-Q-TOF-MS离子流图，如图1所示。

数据采用Micro mass Marker lynx软件进行处理，根据正离子模式的一级质谱的分子离子峰得到化合物的准确相对分子质量，计算出其元素组成，再由正离子的二级质谱中碎片信息，结合文献[12-15]，对山豆根用UPLC 分离出的9个主要峰进行分析，推断出其可能的成分，结果见表2。

表2 UPLC-Q-TOF-ESI-MS鉴定的山豆根提取物中的化合物

4 讨论

胆碱酯酶抑制剂是AD治疗的普遍策略，人们对植物中的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂进行了大量筛选，发现生物碱、萜、黄酮、香豆素等类成分具有抑制乙酰胆碱酯酶的作用[16]。生物碱如石杉碱甲、加兰它敏等因具有高的抑制活性和强的选择性已用于临床，此类药物多是选择性AchE抑制剂，长期服用药效降低、外周不良反应较大。基于BuChE抑制剂的动物实验和临床试验的研究结果，发展特异性的BuChE抑制剂已逐渐成为一个新的研究方向。尤其对于中药提取物，发展中药的BuChE抑制剂有可能改善AD的临床治疗现状。

超高压液相色谱(UPLC)是一个集高分辨率、高灵敏度和高速度于一身的现代分离技术[17]，串联四级杆飞行时间质谱(Q-TOF-MS)是高分辨率串联质谱，其显著特点是灵敏度高和选择性强，得到的质谱图数据完整且品质高，可以测得化合物准确分子质量，对于成分复杂的样品分析与鉴定有其特有的作用[18]。本实验根据碎片的精确相对分子质量和参考文献的信息，可得到9个峰对应化合物的信息。

苦参碱是豆科植物苦参、苦豆子和山豆根等药材的主要活性成分[19]。传统中医学认为，当脏腑虚衰或外邪侵袭，原有机体平衡被打破，体内的生理、病理产物(如痰浊、癖血等)不能及时排除，这些内生之毒蕴积体内日久化热而形成“浊毒”。最终导致“浊毒”结滞于络脉。这种“毒损络脉”的病理改变是多种疾病的关键环节。当浊毒损伤脑络时，脑窍雍塞，神机失统，则发生痴呆。本实验首次发现山豆根提取物具有抑制丁酰胆碱酯酶活性的作用，其主要化学成分为苦参碱类生物碱，属于喹诺里西啶型生物碱，分别是槐醇、苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、9a-羟基苦参碱、14β-羟基氧化苦参碱、Lamprolobine。目前尚未见关于山豆根提取物治疗老年痴呆疾病的相关报道，本课题对研发抗老年痴呆新药提供了科学依据，拟对这些活性提取物做进一步的跟踪分离以获得活性先导化合物。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：25-26.

[2] 丁佩兰.山豆根和苦参化学成分的比较研究[D].上海：复旦大学，2004：4-6.

[3] 王君明，崔瑛.山豆根化学成分、药理作用及毒性研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(4)：229-232.

[4] 吴海燕，周金云.治疗阿尔茨海默病药物的研究进展[J].中国新药杂志，2004，13(7)：583.

[5] 邹垒，全明海，程永强，等.乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究进展[J].食品科学，2005，26(增刊)：105.

[6] GREIGNH，UTSUKIT，INGRAMDK.Selective butyrylchol-inesterase inhibition elevates brain acetylcholine，augments learning and lowers Alzheimerbeta-amyloid peptide in rodent[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(47)：17213-17218.

[7] GIACOBINIE.Selective inhibitors of butyrylcholinesterase：a valid alternative for therapy o Alzheimer’s disease?[J].Drugs Aging，2001，18(12)：891-898.

[8] GIACOBINIE.Cholinesterase inhibitors：new roles and therapeutic alternatives[J].Pharmacol Res，2004，50(4)：433-440.

[9] GreigN H，LahiriD K，SambamurtiK.Butyrylcholinesterase：an important new target in Alzheimer’s disease therapy[J].Int Psy-chogeriatrics，2002，14：77-91.

[10] Bullock.R，Lane R.Executive dyscontrol in dementia，with emphasis on subcortical pathology and the role of butyrylcho linesterase[J].Curr Alzheimer Res，2007，4(3)：277-293.

[11] 高梅，刘艾琳，杜冠华.丁酰胆碱酯酶抑制剂的高通量筛选[J].中国新药杂志，2009，18(12)：1145-1148.

[12] 刘倩，张宏桂，刘永刚，等.HPLC-MSn法分析复方苦参注射液的化学成分[J].中成药，2006，28(10)：1448-1491.

[13] Guoqiang Liu，Jing Dong，Hong Wang，et al.Characterization of alkaloids in Sophora flavescens Ait.by high-performance liquid chromatography- electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2011，54：1065-1072.

[14] Lei Zhang，Liang Xu，Shan-Shan Xiao，et al.Characterization of flavonoids in the extract of Sophora flavescens Ait.By high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector and electrospray ionization mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2007，44：1019-1028.

[15] Hanqing Wang，Sheng Guo，Dawei Qian，et al.Comparative analysis of quinolizidine alkaloids from different parts of Sophora alopecuroides seeds by UPLC-MS/MS[J].J Pharm Biomed Anal，2012，67-68：16-21

[16] 杨建红，陶媛媛，张云梅，等.药用植物中乙酰胆碱酯酶抑制剂研究进展[J].云南化工，2006，33(6)：78.

[17] Geng Peng，Bai Gang，Meng Xiansheng，et al.Screening for metabolites of acarviostatin family aminooligosaccharides in rats using ultra-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2009，50(5)：917-923.

[18] Jianliang Zhou，Guizhong Xin，Ziqi Shi，et al.Characterization and identification of steroidal alkaloids in Fritillaria species using liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time of flight tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2010，1217(45)：7109-7122.

[19] 刘梅，刘雪英，程建峰.苦参碱的药理研究进展[J].中国中药杂志，2003，28(9)：801-804.

Analysis of Chemical Constituents of Effective Part of Anti-butyrylcholinesterase ofSophoratonkinensisby UPLC-Q-TOF-MS

WANG Zenghui1，WANG Dongmei1，LIU Ailin2，HUANG Linfang1*

(1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science，Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China)

Objective：Alzheimer’s disease (AD)，is a common old age chronic degenerative nerve disease.Using cholinesterase inhibitor to improve AD patients choline levels，is currently the only acknowledged drug treatments.Methods：High-throughput drug screening was applied to screen butyrylcholinesterase inhibitory activity ofSophoratonkinensisextracts，and analyzed the active ingredients，The constituents inS.tonkinensiswere determined by UPLC/Q-TOF-MS.Herbs were percolated with petroleum ether，ethanol，ethyl acetate and water，and the corresponding parts of the four extraction were obtained.BuChE inhibitory activity of the candidate compounds was assayed based on thionitrobenzoication (DTNB) method.The mass spectrometer equipped with electrospray ionization source was used as defector and operated in data collected under the positive ion modes.Results：The ethanol extraction part ofS.tonkinensisshowed a strong activity.9 kinds compounds were analyzed and identified，among them 7 mainly were matrine type alkaloids，including sophoranol，sophoridine，matrine，oxymatrine，9a-Hydroxymatrine，lamprolobine，14β-Hydroxyoxymatrine，2 flavonoids were kushenol I/N，kushenol O.Conclusion：The study indicated that extracted with ethanol ofS.tonkinensishas significant butyrylcholinesterase inhibition activity for the first time，and IC50values is 15.169 μg·mL-1，the main compounds mainly is alkaloids of matrine，that indicated thatS.tonkinensis，has a certain effect on BuChE，which will provide scientific basis for AD drug resistance research.

Butyryl cholinesterase inhibitor；high-throughput drug screening；Sophoratonkinensis；extract；active ingredients；UPLC-Q-TOF-MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.008

2014-12-19)

国家自然科学基金(81274013，81473315)；国家自然科学基金重点项目(81130069)

*

黄林芳，副教授，硕士生导师，研究方向：中药资源与质量评价；Tel：(010)57833197，E-mail： lfhuang@implad.ac.cn