聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法对太白贝母鉴别检验的适用性探讨△

张文娟，尚柯，魏锋*，马双成*

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.成都市食品药品检验研究院，成都 610045)

·基础研究·

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法对太白贝母鉴别检验的适用性探讨△

张文娟1，尚柯2，魏锋1*，马双成1*

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.成都市食品药品检验研究院，成都 610045)

目的：探讨聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)对于太白贝母的适用性。方法：采集太白贝母野生及栽培品，收集市场上太白贝母伪品，利用性状、PCR-RFLP鉴别法、DNA序列分析三种方法分析太白贝母与常见伪品的区别。结果：从性状上看，太白贝母栽培品与伪品往往非常相似，较难辨别；通过PCR-RFLP方法可以正确、客观的鉴别太白贝母与常见伪品，基于ITS2 的DNA条形码方法进一步验证了PCR-RFLP法的准确性。市场上太白贝母的伪品多为伊犁贝母。结论：PCR-RFLP鉴别法可准确鉴别太白贝母与其伪品；市场上太白贝母伪品较多，应加强监管。

太白贝母；伊犁贝母；鉴别；性状；聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)；内转录间隔区(ITS)

太白贝母FritillariataipaiensisP. Y. Li为百合科贝母属多年生草本植物，其干燥的鳞茎作为药用。根据《城口厅志》记载，早在清道光二十三年 (公元1843 年) 城口就有贝母药用[1]。《中华人民共和国药典》 2010 版将太白贝母作为川贝母的原植物收载[2]，这给太白贝母资源的开发带来了机遇，同时也给太白贝母野生资源的保护带来了新的挑战，增加了紧迫感。

野生太白贝母资源主要分布在大巴山、巫山及武陵山海拔1860～2500 m 的山坡草丛或灌木丛中，资源稀少，呈带状或片块状分布。太白贝母又称尖贝、川东贝母，主产重庆市巫溪、城口和陕西太白县，具有引种栽培适应性强、产量高的特点，为目前川贝母中最易栽培的品种之一，目前市场上的太白贝母以栽培品为主[3-4]。

太白贝母栽培品的出现也带来了新的问题。有些栽培品与市场上川贝母的常见伪品(如伊贝母)相比，在外观上非常相似，给鉴别检验带来了一定的困难。《中华人民共和国药典》 2010 版 第一增补本中，收录了基于ITS序列的川贝母PCR-RFLP鉴别法[5]。ITS(internal transcribed spacer)是核糖体RNA基因的非转录区，包括ITS1和ITS2两个部分。该区域在物种内差异不大，然而种间差异较明显，因而非常适用于植物分类学研究和中药材的基原鉴定[6，7]。PCR-RFLP鉴别法即在PCR 的基础上，对特异片段进行切割，如果酶切位点发生了突变，便不能被切割；片段是否被切割可以通过琼脂糖凝胶电泳法检测。由于川贝母基因组rDNA的ITS1区段存在限制性内切酶SmaI的识别位点，而贝母属其他品种在该区域没有这一位点，因此可以用这种方法区别川贝母和其他贝母[8]。

该方法从DNA角度对样品进行分析鉴别，不受外观变异的影响，也不易被药材取样部位、放置时间等因素干扰，结果客观、稳定、准确。川贝母基原多样、外观多变，一直以来其真伪鉴别是个难点问题，而该方法的出现无疑为解决这一难题提供了强有力的武器。检验人员在用该方法检验“太白贝母”样品时，发现较多批次不合格，其中多为栽培品。这些被判为了不合格的“太白贝母”本来就是伪品，还是发生了栽培变异，从而导致该方法不适合太白贝母栽培品的检验？为了揭开这一疑问，我们收集了太白贝母野生品和栽培品，以及市场上太白贝母的样品，对这些样品进行性状、PCR-RFLP以及DNA条形码分析，结果发现正品太白贝母具有符合药典标准的性状特征，PCR-RFLP法检验亦符合药典相关标准规定，PCR-RFLP法检验判定为不合格的太白贝母样品，用基于ITS2的DNA条形码方法进一步得到了验证。我们的研究结果提示，PCR-RFLP法适用于太白贝母的鉴别检验；市场上太白贝母伪品较多，以伊贝母最为常见。本研究肯定了PCR-RFLP法在太白贝母鉴别中的适用性，在一定程度上揭示了太白贝母的市场状况，为其市场监控检验提供了理论和技术指导。

1 仪器材料与方法

1.1 仪器和材料

1.1.1 仪器

PCR仪(ABI VERITI)，分析天平(Mettler AB135-S)，纯水仪(Millipore公司)，电泳仪(EPS-301，Amersham)，全自动凝胶成像系统(SyngeneGeneGenius)，球磨仪(M400，Retsch)，微量紫外分光光度计，水浴锅。

1.1.2 试剂

快捷型植物基因组提取试剂盒(DP321，天根生化科技有限公司)，Ex Taq(DRR100B，TaKaRa)，dNTP Mixture 10 mM(N0447，New England Biolabs)，Sma I(R0141，New England Biolabs) GelRed(41003，Biotium)，琼脂糖(BLOWEST)，GelRed(Biotium)，Tris碱，冰醋酸，EDTANa22H2O(国药集团化学试剂有限公司)，引物(华大基因)上游：5‘-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3’下游：5‘-GCTACGTTCTTCATCGAT-3’，用于测序的引物(华大基因)上游：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG-3’，下游：5’-TCCTCCGCTTA TTGATATGC -3’。

1.2 方法

1.2.1 样品来源 本实验所用太白贝母野生品为野外采集并经过相关专家确认，栽培品部分采自栽培基地，部分为厂家送样。

1.2.2 样品处理 取太白贝母样品一粒，用酒精棉球将表面擦拭干净，晾干；用球磨仪磨成极细粉末，称取粉末样品约30 mg备用。

1.2.3 DNA提取和定量分析 按照基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。用微量紫外分光光度计进行DNA定量。

1.2.4 聚合酶链式反应(PCR)反应条件

预变性94 ℃ 5 min

反应循环(35轮) 94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s

最后延伸 72 ℃ 5 min

1.2.5 SmaI酶切反应：反应体系20 μL——取PCR产物10 μL，加入SmaI 0.5 μL，反应缓冲液2 μL，高压蒸汽灭菌的去离子水7.5 μL。

1.2.6 琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像：使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，电压5V/cm，约40 min；之后使用紫外凝胶成像仪拍照并保存结果。1.2.7 序列测定：PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min；反应循环(35轮)94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后延伸 72 ℃ 5 min。PCR反应体系25 μL：DNA模板1 μL，上下游引物各0.2 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，dNTP(10 mM)0.6 μL，反应缓冲液2.5 μL，高压蒸汽灭菌的去离子水(ddH2O)20.3 μL[5]。PCR样品送华大基因完成测序。

1.2.8 序列分析：用Codoncode Aligner 4.06(Codoncode Co.，USA)软件进行序列拼接及校对，去除序列两端的低质量部分。利用ITS2数据库(http：//its2-old2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg. de/cgi-bin/index.)，去除序列两端5.8S和28S区域，获得完整的ITS2序列。用MEGA5.0软件，对不同样品的ITS2序列进行比对(Clustal W)及变异位点分析。

2 结果

2.1 性状特征

收集野生太白贝母样品10批，太白贝母栽培品10批及以太白贝母送检的样品6批。野生样品由中国食品药品检定研究院张南平老师鉴定。

野生太白贝母以青贝多见，即类扁球形，鳞叶大小悬殊，大瓣与小瓣抱合不紧；顶部闭合，先端尖；小瓣中下部近等宽，先端渐尖；大瓣基部明显隘缩状。高0.4～1.0 cm，直径0.6～1.1 cm，呈黄白色，表面较粗糙，有褐色斑点，气微，略苦。

太白贝母栽培品在性状上变异较大，呈类长圆柱形，鳞叶大小悬殊，抱合紧密；顶部闭合，先端钝圆，基部明显隘缩状。高0.7～1.8 cm，直径0.9～1.6 cm。表面及气味特征似野生品种。

以“太白贝母”送检的6批样品，多呈类圆锥或圆柱形，外层鳞叶两瓣，肥大，一片较大或近等大，抱合。顶端稍尖，少有开裂，基部微凹陷。与野生太白贝母及其栽培品相比，个头较大，一般高1.5～2.0 cm，直径1.0～1.5 cm。表面及气味特征与野生和栽培太白贝母无明显差异(图1，表1)。

A 太白贝母(野生)；B 太白贝母(栽培)；C和D：太白贝母伪品(伊贝母)图1 太白贝母及伪品伊贝母

样品名称形状大小色泽表面气味太白贝母(野生)呈类扁圆锥形,鳞叶大小悬殊,大瓣与小瓣抱合不紧;顶部闭合,先端尖;小瓣中下部近等宽,先端渐尖;大瓣基部明显隘缩状高0.4～1.0cm,直径0.6～1.1cm黄白色较粗糙,有褐色斑点气微,味微苦太白贝母(栽培)呈类长圆柱形,鳞叶大小悬殊,抱合紧密;顶部闭合,先端钝圆,基部明显隘缩状高0.7～1.8cm,直径0.9～1.6cm黄白色较粗糙,有褐色斑点气微,味微苦伪品(伊贝母)呈类圆柱形,外层鳞叶两瓣,肥大,一片较大或近等大,抱合。顶端稍尖,少有开裂,基部微凹陷。高1.5～2.0cm,直径1.0～1.5cm黄白色较粗糙,有褐色斑点气微,味微苦

2.2 PCR-RFLP结果

按照《中华人民共和国药典》2010版第一增补本 川贝母项下的PCR-RFLP鉴别法，我们对这些太白贝母样品进行了检测。所有野生太白贝母样品的PCR产物都能够被限制性内切酶Sma I切成两个片段，大小位于100～250bp，即符合《中华人民共和国药典》的相关规定。太白贝母栽培品10批中有8批也得到相同的结果；另有2份栽培品，其PCR产物不能被 Sma I 酶切，即不符合《中华人民共和国药典》的相关规定(图2，3，4)。所有标为“太白贝母”的待检样品，其PCR产物均不能被 Sma I 酶切。DNA测序结果提示，这些不符合《中华人民共和国药典》相关规定的“太白贝母”样品实际为伊犁贝母。

a：PCR产物；b：PCR产物被SmaI酶切后；1-6：太白贝母(野生)；M：DNA分子量标记；B：空白对照；P：阳性对照图2 太白贝母(野生)的PCR-RFLP结果

1-4：太白贝母(栽培)；M：DNA分子量标记；B：空白对照；P：阳性对照图3 太白贝母(栽培)的PCR-RFLP结果

a：PCR产物；b：PCR产物被 SmaI酶切后；1-6：太白贝母检品 M：DNA分子量标记；B：空白对照；P：阳性对照图4 太白贝母检品的PCR-RFLP结果

2.3 以ITS2作为分子标记的DNA条形码和序列分析

我们选择被PCR-RFLP鉴定法判定为不符合规定的样品及部分正品的PCR产物进行测序，得到样品DNA的ITS2区段，BLAST检索NCBI的核酸数据库，得到样品的基原信息，用以佐证PCR-RFLP的结果。被PCR-RFLP方法判定为合格的样品，确实为太白贝母；而判定为不合格的太白贝母样品，DNA条形码方法的分析结果为伊犁贝母(表2)。即两种方法的结果是一致的，说明PCR-RFLP法可以用于太白贝母的检验。

进一步对样品DNA的ITS2 序列进行分析，发现太白贝母的ITS2为238bp，伊犁贝母为239bp，二者之间共存在12处变异，其中伊犁贝母在ITS2序列的第34位插入了一个“G”，因此总长度比太白贝母多一个碱基(图5)。

3 讨论

按照《中华人民共和国药典》2010版第一增补本的规定，太白贝母被作为川贝母来源之一[5]。因其引种栽培适应性强、产量高，故市场上的太白贝母以栽培品多见[3-4]。然而栽培品性状变异较大，与其它贝母属植物来源的贝母(如伊犁贝母)相似度较高，因此仅依靠性状鉴别往往难以得出真伪与否的结论。PCR-RFLP鉴别法与仅凭肉眼观察的形状鉴别法相比，客观，准确，很好的解决了这一难题[5]。然而，利用该方法对市场上的太白贝母进行检验之后，发现很少有合格产品。面对这种情况，检验人员不禁产生了疑虑：究竟是市场上太白贝母伪品多，还是该PCR-RFLP鉴别法不适用呢？本研究通过对基原明确的太白贝母样品以及检品，同时进行性状、PCR-RFLP和DNA条形码的分析，明确了正品太白贝母，无论野生还是栽培品，均应符合《中华人民共和国药典》2010版第一增补本川贝母项下PCR-RFLP鉴别法的规定进行测序的样品中，有2批(符合和不符合PCR-RFLP鉴别法规定的各有1批)样品测序结果因严重套峰而导致测序失败。溯源样品发现这两批样品真菌污染非常严重，可能PCR产物中存在真菌ITS的污染，从而导致测序套峰的出现。尽管我们尽可能去除真菌污染部分之后，重复试验并再次送样测序，仍然是严重套峰的结果。ITS存在多拷贝现象[9]，也可导致套峰的出现。究竟是因为真菌污染还是ITS多拷贝，目前尚不清楚。

表2 样品信息及对应的PCR-RFLP、DNA条形码鉴定结果

图5 太白贝母与常见混伪品伊犁贝母的序列比对分析

在本研究中，DNA条形码技术作为对PCR-RFLP结果的验证方法，起到了关键性作用。由于可以精确知晓待鉴定药材的基因序列，DNA条形码的方法较之其他的DNA分子鉴别法，其结果更为准确、可靠。因此，当我们在实际工作中遇到用其他方法难以鉴别的中药材时，可采用该方法予以检验，从而得到比较确定的结论。目前，中药材DNA条形码方面的应用研究已有较大进展：对于现行《中华人民共和国药典》收录的绝大多数中药材品种，已获得其准确的DNA条形码序列；并且，在此基础上，将二维码技术与DNA条形码技术相结合，为每个药材基原物种提供标准二维DNA条形码，有利于DNA条形码信息在不同平台间转换，为二维DNA条形码技术在实际流通监管工作中的应用提供理论基础，能有效实现对中药材流通的数字化监管，推动中药材流通监管现代化、国际化进程。这些研究成果为DNA条形码在中药材鉴定中的应用打下了良好的基础。由陈士林教授课题组起草的“中药材DNA条形码分子鉴定指导原则”已收录入《中华人民共和国药典》，表明该技术面向应用迈出了坚实的一步，未来的应用前景十分广阔[10-13]。本研究结果提示，市场上太白贝母伪品较多，需加强监管力度。在未来，如果二维DNA条形码技术得到推广应用，相信类似贝母这样基原复杂中药材的市场乱象将得到很好控制。

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Applicability of PCR-restriction Fragment Length Polymorphism Method in Identification of Fritillaria taipaiensis Bulbus

ZHANG Wenjuan1，SHANG Ke2，WEI Feng1*，MA Shuangcheng1*

(1.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China；2.Chengdu Institutes for Food and Drug Control，Chengdu 610045，China)

Objective：To explore the applicability of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) on identification of Fritillaria taipaiensis Bulbus.Methods：The samples of wild and cultivatedF.taipaiensisand the samples from the market were colleeted, and they were identified from the common adulterants adulterants based on characteristics，PCR-RFLP，and DNA sequence analysis.Results：It was difficult to identifyF.taipaiensisfrom its adulterants by characteristics as they showed similar appearance. With the method of PCR-RFLPF.taipaiensiswas accurately and objectively identified，which was further verified by DNA barcoding based on ITS2. On the market，most of the adulterants ofF.taipaiensiswereF.pallidiflora.Conclusion：The method of PCR-RFLP could be successfully applied in the identification ofF.taipaiensis. The adulterants ofF.taipaiensison the market are so common that its quality control needs to be strengthened.

Fritillariataipaiensis；F.pallidiflora；identification；characteristics；polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)；internal transcribed spacer (ITS)

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.006

2015-08-03)

国家自然科学基金青年科学基金项目(31200673)；重大新药创制国家科技重大专项(2014ZX0930437001，2014ZX0930437002)

*

马双成，博士，研究员，研究方向：中药材检验与质量标准研究；Tel：(010)67095272，E-mail：masc@nifdc.org.cn 魏锋，博士，研究员，研究方向：中药材检验与质量标准研究；Tel：(010)67095432，E-mail：weifeng@nifdc.org.cn