鸡血藤总黄酮对坐骨神经损伤大鼠机械痛敏影响的实验研究

刘仰斌，张志花，陈亚运（赣南医学院，江西 赣州 341000）

鸡血藤总黄酮对坐骨神经损伤大鼠机械痛敏影响的实验研究

刘仰斌，张志花，陈亚运
（赣南医学院，江西 赣州 341000）

目的 研究鸡血藤总黄酮对坐骨神经损伤（chronic constriction injury of the sciatic，CCI） 大鼠机械痛敏和脊髓谷氨酸含量的影响。方法 40只大鼠随机均分为4组：对照组（腹腔注射生理盐水，不手术）、假手术组（分离坐骨神经但不结扎+腹腔注射生理盐水）、模型组（坐骨神经结扎+腹腔注射生理盐水）、鸡血藤总黄酮处理组（坐骨神经结扎+腹腔注射鸡血藤总黄酮20 g/kg），连续给药4周。运用机械缩足反射阈值检测术后3、7、10、14、21、28 d大鼠机械痛敏。运用高效液相法测定大鼠术后14、28 d脊髓背角中谷氨酸的含量。结果 与模型组比较，处理组术后第10、14、21、28天的机械缩足反射阈值明显升高（P＜0.05, 或P＜0.01）；在第14天及第28天观测到鸡血藤总黄酮可显著降低大鼠脊髓背角谷氨酸的含量（P＜0.01）。结论 鸡血藤总黄酮可减轻神经病理性痛大鼠的机械痛敏，其机制可能与降低脊髓背角谷氨酸的含量有关。

鸡血藤；总黄酮；神经病理性痛；机械痛敏；谷氨酸

本文引用：刘仰斌, 张志花, 陈亚运. 鸡血藤总黄酮对坐骨神经损伤大鼠机械痛敏影响的实验研究[J]. 医学研究与教育, 2015, 32(1): 7-11.

神经病理性疼痛的发病机制较为复杂，有实验表明谷氨酸和N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）系统参与了神经病理性疼痛的形成过程[1]。NMDAR的激活和磷酸化在神经病理性痛的形成和维持中起着重要作用。目前神经病理性痛的治疗手段还是以药物（如氯胺酮等）为主，但由于存在诸多不良反应，其临床应用受到了极大的限制[2]。因此，对尚未有合适治疗效果的神经病理性痛患者来说，寻求中草药的治疗途径值得尝试。大鼠坐骨神经损伤（chronic constriction injury of the sciatic，CCI）模型，可引起大鼠机械痛敏，类似临床神经病理性疼痛的症状，是公认的神经病理性疼痛模型，已成为应用最广泛的神经病理性疼痛模型之一。

鸡血藤是一种传统的活血化瘀药材，药理研究证实，鸡血藤具有较强的抗氧自由基、抗心律失常、改善血液系统、镇痛、抗炎、抗病毒活性、抗肿瘤、抗心肌缺血等作用[3-6]。研究表明其含有多种成分，如黄酮、有机酸、蒽醌、三菇、甾体等[7]，其中黄酮类成分是鸡血藤中的主要活性成分。为进一步研究鸡血藤黄酮的药理作用，应用大鼠CCI模型，模拟临床神经病理性疼痛的症状，观察鸡血藤总黄酮对CCI大鼠机械痛敏及对脊髓背角中谷氨酸含量的影响，以期为鸡血藤总黄酮在临床上的应用提供理论和实验依据。

1　材料与方法

1.1药品与试剂

鸡血藤总黄酮（纯度为85%）按照刘仰斌等[5]建立的方法先配制好，浓缩成2.5 g/mL的溶液，并储存于冰箱中以备实验需要；乙腈（南京化学试剂有限公司）、三氟乙酸（美国Halo carbon公司）、1%戊巴比妥钠(美国Sigma公司），其他试剂均为市售分析纯。

1.2主要仪器设备

机械触诱发痛测定仪（美国 Sigma公司）；手动匀浆机（江苏金坛环宇科学仪器厂）；原子-Ⅱ型实验室专用超纯水机（江西亚华精密仪器厂）；Tc-15套式恒温器（海宁市新华医疗器械厂）；电热恒温干燥箱（湖北黄石市医疗器械厂）；超速低温离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；高效液相色谱仪（美国Agilent Technologies公司）；紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；色谱柱820000-999（美国Agilent Technologies）；不锈钢动物解剖台（上海标普公司）。

1.3高效液相色谱条件

Agilent高效液相色谱仪，Agilent反相色谱柱，柱温30 ℃。流动相A：0.5 mL三氟乙酸+500 mL双蒸水。流动相B：0.5 mL三氟乙酸+500 mL乙腈。二元梯度洗脱：（T，B%），（0，0），（12，30），（15，30），（16，0），（20，0），进液量1 mL/min，检测时间20 min。荧光检测器：激发波长330 nm，发射波长455 nm。

1.4动物分组与处理

SPF级SD大鼠40只，自由饮食，均为雄性，体质量（180±20）g，由赣南医学院实验动物中心提供，许可证号为SYXK（赣）2007-0002。根据实验动物使用的3R原则，所有SD大鼠在实验前均给予人道的关怀，实验前适应性饲养1周。实验时40只SD大鼠随机分为4组：正常对照组（腹腔注射生理盐水）、假手术组（分离坐骨神经但不结扎+腹腔注射生理盐水）、模型组（坐骨神经结扎+腹腔注射生理盐水）、鸡血藤总黄酮处理组（坐骨神经结扎+腹腔注射鸡血藤总黄酮20 g/kg）。每组10只，其中5只用于机械痛敏测定，并最后一天（第28天）机械痛敏测定结束后处死取脊髓测谷氨酸含量；另外5只用于脊髓谷氨酸含量的测定，于术后第14天处死取脊髓测谷氨酸含量。

1.5方法

1.5.1CCI模型的建立

参照Bennett等[8]的方法，对SD大鼠行坐骨神经损伤（CCI）手术。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（35 mg/kg）麻醉，麻醉成功后将其俯卧位固定于动物解剖台上。在无菌条件下，于右侧大腿股骨外缘凹陷中部切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露一段坐骨神经主干（约4 mm左右），取羊肠线环绕神经干轻度结扎，共结扎4道，力度以不影响神经外周血流为原则，同时又可以引起大鼠小腿肌肉微颤。用0.9%生理盐水冲洗切口，最后逐层关闭切口，切口未使用抗感染药物。制备成大鼠坐骨神经损伤模型（CCI模型）。术闭放回原笼，单笼饲养，自由饮食。

1.5.2给药方法

于CCI术后第1天开始，鸡血藤总黄酮处理组大鼠腹腔注射鸡血藤总黄酮（20 mg/kg，溶于生理盐水5 mL中），其余各大鼠腹腔注射等量生理盐水（5 mL），所有大鼠腹腔均1次/天，连续4周。

1.5.3机械痛敏的测定

采用机械触诱发痛测定仪测定大鼠机械痛敏。各组大鼠均在术前（当天），术后3、7、10、14、21、28 d检测大鼠机械缩足强度。将大鼠置于透明的有机玻璃箱中，底为1 cm×1 cm的铁丝网，实验前先适应15 min。采用测定仪由下往上垂直刺激大鼠右侧足底光滑皮肤，逐渐加大刺激强度，记录出现缩足反应（如舔足、甩腿等）时的刺激强度为机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT，单位为g），最大刺激强度不超过90 g，每只大鼠测定5次，每次间隔5 min，取其平均值。

1.5.4脊髓谷氨酸含量的测定

于术后第14天和第28天各组分别处死5只大鼠，取腰段脊髓组织，称质量，加入0.1 mol PBS（w∶V，1∶9），用电动玻璃匀浆器（3 000 r/min）冰浴匀浆5 min；吸取0.1 mL匀浆液，加0.2 mL甲醇，摇匀，1 500 r/min、4 ℃离心30 min去蛋白，取上清液。通过高效液相色谱法测定大鼠腰段脊髓中谷氨酸的含量（单位为μmol/L）。

1.6统计学处理

2　结果

2.1鸡血藤总黄酮对CCI大鼠机械痛敏的影响

对照组、假手术组、模型组和鸡血藤总黄酮处理组大鼠在术前机械痛敏的差异无统计学意义（P>0.05）。术后第3、7、10、14、21、28天，模型组出现机械痛敏下降。与模型组比较，鸡血藤总黄酮处理组治疗后第10、14、21、28天，机械痛敏显著上升（P<0.05，或P<0.01）。见表1。

表1　不同时间点各组机械痛敏的比较（±s）

表1　不同时间点各组机械痛敏的比较（±s）

与对照组和假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05,cP<0.01。

组别n0 d/g3 d/g7 d/g10 d/g14 d/g21 d/g28 d/g对照组531.91±3.1531.20±3.4133.1±3.5032.21±3.4031.40±3.3231.80±3.1231.61±3.03假手术组531.80±3.1430.84±3.3032.8±3.3132.02±3.5131.80±3.4131.52±3.3330.80±2.94模型组532.14±2.91 15.42±3.52a18.3±3.22a16.14±3.42a14.31±3.13a15.01±3.20a14.51±3.14a鸡血藤总黄酮处理组531.70±3.3220.52±3.3121.9±3.4325.83±3.23b28.51±3.20c30.14±3.40c30.82±3.22c

2.2鸡血藤总黄酮对CCI大鼠脊髓谷氨酸含量的影响

运用高效液相法（HPLC）测定术后第14天和第28天大鼠脊髓谷氨酸水平。结果显示：在第14天，与对照组和假手术组相比，模型组谷氨酸水平显著升高（P<0.01），鸡血藤总黄酮处理组谷氨酸明显降低，基本恢复到正常水平；在第28天，与对照组和假手术组相比，模型组谷氨酸水平显著升高（P<0.01），鸡血藤总黄酮处理组谷氨酸明显降低，恢复到正常水平。结果与鸡血藤总黄酮对CCI大鼠机械痛敏的影响相一致。

表2　14 d、28 d后各组大鼠脊髓谷氨酸含量的比较（±s）

表2　14 d、28 d后各组大鼠脊髓谷氨酸含量的比较（±s）

与对照组和假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

组别n14 d/(μmol/L)28 d/(μmol/L)对照组53.14±1.223.50±1.34假手术组53.33±1.403.60±1.21模型组56.52±1.34a6.41±1.42a鸡血藤总黄酮处理组53.80±1.21b3.52±1.22b

3　讨论

慢性疼痛，如外周神经损伤和糖尿病神经病变所引起的神经病理性疼痛，可导致患者长期的痛苦并严重影响患者的生活质量[9-10]。据世界卫生组织报道，全世界神经病理性痛患者呈现逐年上升的趋势。目前多数实验研究显示神经系统的结构损伤或功能异常可导致神经病理性疼痛[11]，主要表现为患者机械痛敏和诱发痛。

由于神经病理性痛的发生发展过程比较复杂，现有的药物治疗效果不甚明显而且治疗周期较长，同时治疗的药物有可能会产生严重的不良反应。据报道，目前只有50%左右的神经病理性痛患者治疗后能得到一定程度的缓解[10]，神经病理性痛的临床治疗仍然面临重大的困难。因此，寻找治疗该病的新药物和药物的作用靶点具有重要的临床意义。

神经病理性痛通常表现为外周神经损伤后诱导的神经细胞发生了可塑性变化，即结构和生化功能发生改变，产生痛觉超敏，可发生在外周和中枢神经系统[1]。中枢敏化是脊髓背角传递伤害性信息的神经元活性和兴奋性升高所引起的，它是神经病理性痛发生和维持的关键[1]。据文献[11-12]报道，神经病理性痛的发病机制与诸多受体及离子通道的变化密切相关，涉及神经元伤害性感受器的敏化、受体激活和磷酸化、信号分子、胞内信号通路、痛觉传导通路、离子通道和G蛋白偶联受体功能改变等。有实验[13-14]表明，谷氨酸及其受体在神经病理性痛发生和维持中起重要作用，脊髓背角NMDAR的激活或磷酸化是神经损伤后诱导中枢敏化的必需条件，并参与中枢敏化的发生和维持过程。

有文献报道，脊髓背角NMDAR在参与伤害性信息传递和突触可塑性变化中起关键作用，并且一直以来被作为治疗神经病理性痛的重要靶点[14-15]。随着人们对神经病理性痛发病机制认识的提高，治疗手段主要围绕产生痛敏的神经递质及其受体和胞内信号分子靶点来展开。目前神经病理性痛的临床治疗还是以药物为主，主要有镇痛药、抗炎药和NMDAR拮抗剂等[2]。大量动物实验和临床试验证据表明[16]，非竞争性NMDAR拮抗剂氯胺酮可有效地治疗神经病理性痛，但其会引起一系列不良反应，比如食欲减退和致幻等；而长期应用止痛药易发生耐受和成瘾等。由于神经病理性痛治疗的周期长，药物的不良反应较大，因此极大地限制了它们对神经病理性痛治疗的有效性。基于此，寻求治疗神经病理性痛效果好且不良反应小的药物尤为迫切。

作为一种活血化瘀中草药，在民间鸡血藤常用于治疗风湿痹痛、痛经、神经痛、血虚萎黄、类风湿性关节炎等症。现代药理研究[3-7]发现，鸡血藤有改善造血系统、抗血栓形成、抗氧化、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、镇痛、镇静和催眠的功效。许蓬娟等[4]研究后发现鸡血藤具有镇痛作用，认为鸡血藤中的某些黄酮类具有中枢抑制、解痉作用。为弘扬祖国医学，充分挖掘鸡血藤的作用功效，进一步寻求鸡血藤在神经病理性痛治疗方面的途径，本文研究了鸡血藤总黄酮干预神经病理性痛的作用，结果表明：鸡血藤总黄酮具有镇痛作用，对神经病理性痛的机械痛敏有明显的缓解作用。另外，本研究发现鸡血藤总黄酮可显著降低神经病理性痛大鼠脊髓背角的谷氨酸含量，并且与其缓解机械痛敏的作用相一致。这进一步提示谷氨酸在神经病理性痛的发生和发展中起关键作用，而且随着注射鸡血藤总黄酮的时间延长，谷氨酸水平将进一步下降直至恢复到正常，显示鸡血藤总黄酮对谷氨酸的影响有长效性，作用持续时间长。该研究提示鸡血藤总黄酮减轻神经病理性痛大鼠的机械痛敏，其作用机制可能与降低脊髓背角谷氨酸的水平有关。至于鸡血藤总黄酮影响脊髓背角谷氨酸含量的机制，有待于进一步的研究。

[1] BASBAUM A I, BAUTISTA D M, SCHERRER G, et al. Cellular and molecular mechanisms of pain[J]. Cell, 2009, 139(2): 267-284.

[2] ATTAL N. Chronic neuropathic pain: mechanisms and treatment[J]. Clin J Pain, 2001, 16(3): 118-130.

[3] 程悦, 符影, 王志宇, 等. 鸡血藤提取物中缩合鞣质的含量测定及其抗肿瘤活性初步研究[J]. 中山大学学报: 自然科学版, 2011, 50(2): 75-80.

[4] 许蓬娟, 辛晓林, 艾洪滨. 中药鸡血藤的镇痛实验研究[J]. 生物医学工程研究, 2008, 27(4): 291-293.

[5] 刘仰斌, 张志花. 鸡血藤提取物对离体缺血再灌注损伤心肌生化指标的影响[J]. 湘南学院学报: 医学版, 2013, 15(4): 6-8.

[6] 刘仰斌, 张志花. 鸡血藤总黄酮对大鼠佐剂性关节炎作用的实验研究[J]. 医学研究与教育, 2014, 31(5): 1-4.

[7] 舒顺利, 应军, 刘军民, 等. 鸡血藤化学成分研究[J]. 中药新药与临床药理, 2012, 23(2): 184-186.

[8] BENNETT G J, XIE Y K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man[J]. Pain, 1988, 33(1): 87-107.

[9] GARRIDO-SUAREZ B B, GARRIDO G, DELGADO R, et al. A Mangifera indica L. Extract could be used to treat neuropathic pain and implication of Mangiferin[J]. Molecules, 2010, 15(12): 9035-9045.

[10] American Pain Foundation. Overview of American pain surveys: 2005-2006[J]. J Pain Palliat Care Pharmacother, 2008, 22(1): 33-38.

[11] LARSSON M, BROMAN J. Synaptic plasticity and pain: role of ionotropic glutamate receptors[J]. Neuroscientist, 2011, 17(3): 256-273.

[12] WANG Jian, LIU Yang, ZHOU Lijun, et al. Magnesium L-threonate prevents and restores memory deficits associated with neuropathic pain by inhibition of TNF-α[J]. Pain Physician, 2013, 16(5): 563-575.

[13] YAN Xie, JIANG E, GAO Men, et al. Endogenous activation of presynaptic NMDA receptors enhances glutamate release from the primary afferents in the spinal dorsal horn in a rat model of neuropathic pain[J]. J Physiol, 2013, 591(4): 2001-2019.

[14] HO Y C, CHENG J K, CHIOU L C. Hypofunction of glutamatergic neurotransmission in the periaqueductal gray contributes to nerve injury induced neuropathic pain[J]. J Neurosci, 2013, 33(18): 7825-7836.

[15] ZHOU Hangyu, CHEN Senrui, PAN Hanli. Targeting N-methyl-D-aspartate receptors for treatment of neuropathic pain[J]. Expert Rev Clin Pharmacol, 2011, 4(3): 379-388.

[16] HAMA A, SAGEN J. Antinociceptive effect of Riluzole in rats with neuropathic spinal cord injury pain[J]. J Neurotrauma, 2011, 28(1): 127-134.

（责任编辑：高艳华）

Experimental study of total flavonoids in Net Cliffbean affecting the mechanical allodynia in CCI rats

LIU Yangbin, ZHANG Zhihua, CHEN Yayun
(Gannan Medical University, Ganzhou 341000, China)

Objective To study the effects of total flavonoids in Net Cliffbean on the mechanical allodynia and glutamate contents in spinal of chronic constriction injury of the sciatic(CCI) rats. Methods 40 rats were randomly divided into 4 groups: control group, sham operation group, CCI group and Net Cliffbean treatment group, with NomralSaline or drugs, once a day, for 4 weeks. Mechanical withdrawal threshold (MWT) was measured as the sign of mechanical allodynia for 3, 7, 10, 14, 21, 28 day. The lumbar segment of the spinal cord was removed for determination of glutamate contents by high pressure liquid chromatography (HPLC) for 14, 28 day. Results Total flavonoids in Net Cliffbean significantly increased the mechanical withdrawal threshold (MWT) compared with model group (P＜0.05 or P＜0.01), and obviously decreased the content of glutamate in the spinal cord (P＜0.01). Conclusion Total flavonoids in Net Cliffbean can relieve the mechanical allodynia in neuropathic pain rats, its mechanism maybe reduced glutamate content in the spinal cord.

Net Cliffbean; total flavonoids; neuropathic pain; mechanical allodynia; glutamate

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.01.002

R27

A

1674-490X(2015)01-0007-05

2014-12-23

刘仰斌（1970—），男，江西赣州人，副教授，硕士，硕士生导师，主要从事免疫细胞与神经疼痛机制研究。E-mail: 15979776628＠163.com。