pEZRThr567在肺鳞癌中的表达及临床病理学意义*

张源，金承龙，王申桐，杨洋，林贞花，金铁峰△(延边大学肿瘤研究所，附属医院皮肤科，吉林延吉3300)

pEZRThr567在肺鳞癌中的表达及临床病理学意义*

张源1▲，金承龙2▲，王申桐1，杨洋1，林贞花1，金铁峰1△
(延边大学1肿瘤研究所，2附属医院皮肤科，吉林延吉133002)

目的:探讨第567位苏氨酸磷酸化的埃兹蛋白(pEZRThr567)在肺鳞癌、癌旁及正常肺组织中的表达及其临床病理学意义。方法:用免疫组化法检测pEZRThr567在肺癌、癌旁及正常肺组织中的表达，并分析其异常表达与临床病理学特点之间的相关性;用免疫荧光染色法检测pEZRThr567在肺鳞癌细胞EBC-1中的定位情况。结果: pEZRThr567蛋白在肺鳞癌组织中的表达明显高于癌旁组织和正常肺组织(P＜0.01);pEZRThr567蛋白主要表达于细胞膜，且其表达与肿瘤分化程度、临床分期和有无淋巴结转移密切相关(P＜0.05)。结论:pEZRThr567蛋白可作为肺鳞癌恶性进展的有效分子指标。

肺鳞癌;埃兹蛋白;免疫组织化学

［ABSTRACT］AIM:To investigate the clinicopathological significance of the protein expression of phosphorylated ezrin at threonine 567(pEZRThr567)in lung squamous cell carcinoma，adjacent tissues and normal tissues.METHODS: pEZRThr567protein was detected in lung squamous carcinoma，adjacent and normal tissues by the method of immunohistochemistry.The correlation of pEZRThr567expression with clinicopathological parameters of lung squamous carcinomaswas also analyzed.The localization of pEZRThr567was detected by immunofluorescence staining in lung squamous cell line EBC-1.RESULTS:The protein expression of pEZRThr567in lung squamous carcinomawas significantly higher than that in the adjacent and normal lung tissues(P＜0.01).pEZRThr567mainly localized on the cellmembrane，and its over-expression significantly correlated with the differentiation，clinical stage and lymph node metastasis in lung squamous carcinoma.CONCLUSION:pEZRThr567may be an effective biomarker for prediction ofmalignant potential and poor prognosis of lung cancer.

［KEY WORDS］Lung squamous carcinoma;Ezrin;Immunohistochemistry

肺癌居于恶性肿瘤死亡率首位［1］，鳞癌为最常见的类型之一［2］。细胞膜骨架连接蛋白埃兹蛋白(ezrin，EZR)属于埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin，ERM)家族成员，可维持细胞的正常形态和运动能力［3］。目前大多数的研究表明EZR蛋白在肺癌中高表达，但国内Chen等［4］认为EZR在肺癌中表达下调。虽然EZR在肺癌的表达研究国内外已有报道，但作用机制仍不明确，而EZR的活化形式即磷酸化EZR在肺癌尤其是肺鳞癌的表达研究国内外未见报道。本文旨在探讨磷酸化EZR蛋白在肺鳞癌、癌旁组织及正常肺组织的表达情况并分析其临床病理学意义，为肺鳞癌的早期诊断提供可靠的分子标志物。

材料和方法

1材料

135例肺鳞癌及其癌旁组织来源于吉林大学第二人民医院和承德医学院附属医院病理科，14例正常肺组织来源于延边大学医学院病理学教研室尸检存档蜡块。肺鳞癌细胞株EBC-1购于ATCC。免疫组化SP两步法检测试剂盒为Dako产品;免疫荧光染色试剂盒购自Invitrogen;phospho-EZR-Thr567 (pEZRThr567)抗体购自Signalway Antibody。

2方法

2.1免疫组化染色石蜡组织以4μm连续切片，pEZRThr567(1∶100)4℃孵育过夜，以标记辣根过氧化物酶的抗兔Ⅱ抗室温孵育45 min，DAB显色，Mayer苏木素复染。为证明EZR蛋白抗体免疫组化检测的特异性，分别以PBS代替I抗作为空白对照，并以已知pEZRThr567阳性着色的切片为阳性对照。免疫组化染色以棕色或金黄色着色判定为阳性染色结果，并根据阳性细胞数的比例将染色结果分为4级。0级为阳性细胞数占0～5%;1级为阳性细胞数占6%～25%;2级为阳性细胞数占26%～50%;3级为阳性细胞数占51%～75%;4级为阳性细胞数占75%以上。

2.2免疫荧光染色人肺鳞癌细胞株EBC-1常规培养至细胞融合度达到90%，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100打孔，BSA封闭，PBS洗涤，pEZRThr567Ⅰ抗(1∶100)室温孵育2 h，Alexa Fluor®488山羊抗兔IgG荧光II抗室温孵育1 h，激光共聚焦显微镜观察并拍照。

3统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计数资料的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1pEZRThr567蛋白在肺鳞癌组织中高表达并主要定位于细胞膜

免疫染色表明，pEZRThr567主要表达于细胞膜及丝状伪足，pEZRThr567在135例的肺鳞癌组织中有107例(79.3%)阳性表达，远高于癌旁组织的67例(13.4%)及正常肺组织的14例(14.3%)，组间比较差异显著(P＜0.01)。同时分析pEZRThr567蛋白定位情况发现其定位于细胞膜及细胞浆，在107例阳性表达的肺鳞癌组织中，细胞膜的表达有86例(80.4%)，而细胞浆的表达为21例(19.6%)，远低于在细胞膜中的表达，且在细胞膜的染色强度高于在细胞浆的染色强度(P＜0.01)，见图1、2。

Figure 1.The expression of the pEZRThr567in normal lung tissues，adjacent lung tissues and lung squamous carcinoma(×200).A:normal lung tissue;B:adjacent lung tissue;C:weakly positive pEZRThr567location on cytoplasm in squamous carcinoma;D:strongly positive pEZRThr567location onmembrane in squamous carcinoma.图1　pEZRThr567在正常肺组织、癌旁组织及肺鳞癌组织中的表达

Figure 2.The pEZRThr567distributed on the cellmembrane，cytoplasm and filopodia，but the distribution on the cellmembrane is furthermore than that on the cytoplasm(×200).图2　pEZRThr567在EBC-1细胞分布的定位分析

2pEZRThr567膜阳性表达与肺鳞癌临床病理因素之间的关系

pEZRThr567膜阳性表达与肿瘤分化程度、临床分期及有无淋巴结转移密切相关，但与患者的性别、年龄、肿瘤大小及是否吸烟不相关，见表1。

讨论

EZR是ERM蛋白家族成员之一，它通过连接细胞膜与细胞骨架来维持细胞的形态和生存能力，对细胞的黏附、分化、运动等起重要调节作用［5］。研究表明，EZR的表达与肿瘤转移密切相关［6-8］。虽然多数研究认为EZR蛋白在肺癌中高表达，但也有研究证实EZR蛋白在肺癌中呈低表达。对于2种不同的结果，可能与选择病例人群、标本例数、统计方法及结果判定标准不同等因素有关。但有关磷酸化EZR的作用机制国内外研究较少，尤其是磷酸化的EZR在肺鳞癌的表达研究未见报道。有研究表明EZR在经过磷酸化修饰后可从休眠状态变为活化状态，并从细胞质向细胞膜定向迁移，完成其生理功能［9］。游昕超等［10］的最新研究证实，EZR蛋白的磷酸化程度决定乳腺癌细胞系MCF-7的迁移能力。另有研究表明EZR蛋白在卵巢癌的表达明显高于癌旁正常组织，且有转移组细胞膜阳性率显著高于无转移组［11］。我们之前的研究表明EZR及其磷酸化蛋白在非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)呈显著高表达并与NSCLC的恶性进展密切相关，而EZR、pEZRTyr353及pEZRThr567中只有pEZRThr567与NSCLC的淋巴结转移具有相关性［12］。一项来自于骨肉瘤的研究同样也表明在EZR、pEZRTyr354及pEZRThr567中只有pEZRThr567表达于细胞膜并与转移密切相关［13］。因此，pEZRThr567可能更适合作为肺鳞癌的分子标志物。Antelmi等［14］的研究证实pEZRThr567蛋白在乳腺癌中高表达，主要定位于细胞膜及伪足。通过应用pEZRThr567点突变干扰方法，使其表达下调后发现细胞侵袭能力及伪足形成率明显减少，这与我们的研究结果基本符合。在本研究中我们通过免疫组化及免疫荧光染色发现，pEZRThr567蛋白在细胞膜及由细胞伸出的丝状伪足上密集分布，而细胞的迁移通常是从伸出丝状/板状伪足后细胞变形，继而以阿米巴样运动开始的。Antelmi等［14］的研究最终证实pEZRThr567与β1整合素结合后促进伪足的形成并最终活化细胞的迁移能力。而pEZRThr567在肺癌，尤其是肺鳞癌的转移过程中是通过哪种渠道起作用的还不得而知，需要更深入的研究。本研究表明，pEZRThr567在肺鳞癌中的表达明显高于癌旁和正常肺组织;在晚期肺鳞癌、有淋巴结转移的肺鳞癌及中低分化肺鳞癌组中其表达明显增高。这提示pEZRThr567的膜阳性表达对于肺癌的恶性进展具有重要的判定价值。

表1　pEZRThr567膜阳性表达与肺鳞癌临床病理参数之间的关系Table 1.Correlation between expression of pEZRThr567onmembrane and clinicopathological parameters of lung squamous carcinoma

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Clinicopathological significance of pEZRThr567expression in lung squamous carcinoma

ZHANG Yuan1，JIN Cheng-long2，WANG Shen-tong1，YANG Yang1，LIN Zhen-hua1，JIN Tie-feng1
(1Cancer Research Center，2Department of Dermatology，Affiliated Hospital，Yanbian University，Yanji133002，China.E-mail:jintf@ybu.edu.cn)

R734.2;R730.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.032

1000-4718(2015)05-0947-04

2014-12-14［修回日期］2015-02-10

国家自然科学基金资助项目(No.61371067)

Tel:0433-2435060;E-mail:jintf@ybu.edu.cn

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