不同方法构建豚鼠膜迷路积水模型的对比研究

蒋子栋　高帆　孙程成北京协和医院耳鼻咽喉科00730首都儿科研究所附属儿童医院耳鼻咽喉科0000

·基础研究·

不同方法构建豚鼠膜迷路积水模型的对比研究

蒋子栋1高帆2孙程成1
北京协和医院耳鼻咽喉科100730
首都儿科研究所附属儿童医院耳鼻咽喉科100020

目的采用不同的方法建立豚鼠膜迷路积水的动物模型并对相关参数进行对比分析，确定目标建模的有效方法。方法80只豚鼠分成四组，每组20只，包括手术单耳建模，手术双耳建模，注射醛固酮组，注射血管加压素组。1月后，取存活的豚鼠的颞骨，分别进行火棉胶和冰冻切片，光学显微镜观察建模状况。通过统计学方法，对不同组间动物的成活率、建模的成功率、耳蜗积水特点、以及制片因素对成像效果影响进行对比分析。结果手术的方法可以分别建立单耳模型和双耳模型，成功率100%（22/ 22），死亡率分别为15%（3/20），75%（15/20）组间有显著性差异P＜0.05。药物的方法建立双耳模型，醛固酮组死亡率为5%（1/20），成功率89.4%（17/19）；血管加压素组死亡率为5%（1/20），成功率73.7%（14/19），成功率在药物组间有显著性差异P＜0.05。手术组总死亡率为45%（18/40），药物组总死亡率为5%（2/ 40），有显著性差异P＜0.01。手术组耳蜗积水程度重度90.9%（20/22），中度18.1%（4/22）；药物组耳蜗积水程度重度21%（8/38），中度47.3%（18/38），轻度31.5%（12/38）。火棉胶和冰冻切片的选择不影响组织切片结果。结论根据实验目标进行选择建模方法，可以节约动物成本，提高建模效率。

膜迷路积水；豚鼠；模型

梅尼埃病是常见的内耳病，引发患者发作性眩晕、波动性感音神经性耳聋、耳鸣和耳闷胀感的症状；它是一种可以致残的疾病，一直是临床研究的热点，2015年颁布了新版梅尼埃病诊断标准［1］，将引发广泛的关注和研究。梅尼埃病没有特异性生物学标志，临床诊断依据症状诊断和排除诊断；它病因不明，唯一明确的是其病理改变是内耳膜迷路积水［2］，临床诊治针对内耳膜迷路积水。因为活体无法进行病理组织学研究，梅尼埃病的基础研究主要依据动物模型。

1965年，kimura［3］首先报道通过手术破坏内淋巴囊和内淋巴管的方法，建立内耳膜迷路积水动物模型，此后，用其它方法成功建模的研究陆续报告［4，5，6］，但缺少不同建模方法间系统的对照研究，尤其是动物死亡率和建模成功率。我们在同一组群中，通过不同的方法建模，包括手术和药物；通过对建模成功率、耳蜗积水程度特点、动物死亡率、切片过程中相关因素对建模的影响的统计学分析以及不同方法建立模型的可能机制进行讨论，寻找节约动物成本，提高建模效率的正确途径，为准备开展梅尼埃病实验学研究人员提供可靠的经验。

1　材料和方法

1.1动物

选健康杂色豚鼠，（普通级，北京芳元缘养殖场，动物许可证：SCXK（京）2009-0014），雌雄不限，体重250-300g，鼓膜正常，耳廓反射灵敏，无眼震及平衡障碍。80只豚鼠随机分成四组，每组20只，包括手术单耳建模，手术双耳建模，注射醛固酮组，注射血管加压素组。饲养1月后，取存活的豚鼠的颞骨，分别进行火棉胶和冰冻切片，光学显微镜观察建模状况。

1.2药物建模

醛固酮组：连续7天腹腔注射醛固酮（SIGMA，706035），剂量100μg/0.1kg，每日一次［7］。加压素组：连续7天腹腔注射精氨酸加压素（SIGMA，V1880），剂量50μg/kg，每日一次［8］。

1.3手术建模

豚鼠麻醉后，麻醉药选用氯胺酮（50mg/kg）、塞拉嗪（3.8g/kg），在手术显微镜下磨去枕骨，暴露硬脑膜及乙状窦后缘，双极电凝处理乙状窦，在硬脑膜外暴露前庭导水管颅内开口处，将内淋巴囊破坏，用0.5mm细钻沿前庭导水管方向钻入，埋入骨蜡，缝合伤口。通过同样方法处理对侧，手术建立双耳模型。术后动物苏醒前放入保温垫上保暖，观察呼吸，定期吸痰。

1.4耳蜗积水程度分度

正常情况下，耳蜗内前庭膜（Reissner's Membrane）以30度直线延伸，将基底膜以上的空间分为前庭阶和蜗管两部分，蜗管面积约为前庭阶的1/2（图1）。当膜迷路积水时，前庭膜向前庭阶方向膨隆，蜗管面积增大。将耳蜗积水粗略分三度，轻度：蜗管的面积占基底膜上总面积的1/3-1/2（图2）；中度：蜗管的面积占基底膜上总面积的1/2-2/3（图3）；重度：蜗管的面积占基底膜上总面积的2/3以上（图4）。

图1　

图2　

图3　

图4　

1.5数据分析

所用数据用SAS软件进行卡方检验，P＜0.05为差异有显著性。

2　结果

2.1病理形态学变化

正常豚鼠，前庭膜为单层细胞结构，从基底膜的中部1/3延伸到耳蜗骨壁内侧。膜迷路积水时，部分前庭膜为复层细胞结构，耳蜗各回前庭膜不同层度向前庭阶方向膨隆，有些与骨壁相连，有些出现前庭膜破裂。

2.2手术的方法可以分别建立单耳模型和双耳模型，药物的方法建立双耳模型，详情见（表1）。比较双耳手术和单耳手术的死亡率，分别为75%（15/20）和15%（3/20），组间有显著性差异P＜0.05。药物组的死亡率皆为5%（1/20）。手术组总死亡率为45%（18/ 40），药物组总死亡率为5%（2/40），有显著性差异P＜0.01。成活动物中，手术组豚鼠建模成功率为100% （22/22），注射醛固酮组成功率89.4%（17/19），注射血管加压素组成功率73.7%（14/19），成功率在药物组间有显著性差异P＜0.05详情见（表2）。手术组耳蜗积水程度重度90.9%（20/22），中度18.1%（4/22）；药物组耳蜗积水程度重度21%（8/38），中度47.3% （18/38），轻度31.5%（12/38）。火棉胶和冰冻切片的选择不影响组织切片结果。

3　讨论

梅尼埃病（Meniere disease，MD）是常见的内耳病，表现为发作性眩晕、波动性感音神经性耳聋、耳鸣和耳胀满感。内淋巴积水（endolymphatic hydrops，EH），又称膜迷路积水，1938年，由Hallpike和Cairns发现其为梅尼埃病的基本病理变化。自1861年，Meniere首先描述症状以来，近1个半世纪的不懈努力和大量研究，目前能够确定的仍然局限于其病理变化为内耳膜迷路积水，临床诊断依然是症状诊断和排除诊断，实验室诊断和临床治疗针对发现和控制内耳膜迷路积水。由于活体无法进行内耳组织形态学研究，膜迷路积水动物模型是研究梅尼埃病发病机制、病理特征、生理改变和治疗方法的重要手段。

Salt和Plontke［9］对内耳膜迷路积水动物模型建模方式和特点进行系统分类，包括急性建模和慢性建模，其中急性建模的方法包括：1）人工内淋巴液注入内淋巴系统引起压力改变；2）脑脊液压力控制的改变；3）115DB低频声刺激诱发；4）透明质酸凝胶注入耳蜗顶转后诱发；5）毒素进入内淋巴引发cAMP控制的改变。慢性建模的方法包括：1）手术建模；2）醛固酮建模；3）血管加压素建模；4）醛固酮和脂多糖建模。国内也有类似综述对建模方法进行分析。到目前为止，已经发表的相关研究文章，主要针对单个建模方法的探讨，缺少建模方法之间优缺点的横向对比。然而，对于即将开展内耳膜迷路积水实验研究的人员而言，亟需了解每种方法的建模细节，通过选择合理方法，提高实验效率。本研究中，我们采用自身研究团队有成功建模经验的、可以推荐未来广泛使用的慢性建模的方法进行对照研究，在同一组群中，通过不同的方法建模，包括手术和药物；通过对建模成功率、耳蜗积水程度特点、动物死亡率及切片过程中相关因素对建模的影响的统计学分析和讨论，寻找节约动物成本，提高建模效率的最佳途径。

表1　组间死亡率对比

表2　组间成功率对比

抗利尿激素（antidiuretic hormone）是下丘脑（视上核和室旁核）合成和分泌的，又称为血管加压素（vasopressin），以神经内分泌颗粒的形式经轴突运送到垂体后叶而得以释放。1999年，Kitano发现膜迷路积水与血管加压素有关［10］。2000年，Takeda等人［4］通过豚鼠腹腔注射精氨酸加压素，建立双耳膜迷路积水。注射血管加压素诱发膜迷路积水的机制不明，顾凤鸣等通过针对大鼠模型的基因芯片研究，推测和内淋巴囊水通道蛋白表达改变有关，建模成功率70%左右［8］。Kitahara等人［11］发现，梅尼埃病患者的眩晕发作与血浆中精氨酸加压素有关，Katagir等人［12］最新发现，延长精氨酸加压素注射时间，动物膜迷路积水的程度增加，成功率达100%。本研究中，注射血管加压素组建模成功率73.7%（14/19），死亡率为5%（1/20），死亡原因不明。醛固酮（aldosterone）又称为盐皮质激素，是由肾上腺外部（球状带）分泌的激素。1997年，Dunnebier等人［6］在用Kimura的方法建立单耳模型1个月后，给予豚鼠注射醛固酮，结果手术耳（手术加醛固酮作用侧）出现中、重度膜迷路积水，而对侧耳（单纯醛固酮作用侧）出现轻度膜迷路积水。我们在Dunnebier等人研究的基础上，单纯注射醛固酮建立动物模型，延长观察时间至3个月，发现双耳皆出现中、重度膜迷路积水，而且膜迷路积水从底转开始［7］。本研究中，注射醛固酮组成功率89.4%（17/19），死亡率为5%（1/20），死亡原因不明。注射醛固酮诱发内耳膜迷路积水的机制不明，推测与其通过作用钠/钾ATP酶活性，影响水钠储留有关。有研究表明，梅尼埃病患者血浆醛固酮并非增高［13］，笔者分析，其结果可能和梅尼埃病病程及临床发作分期不明确有关。未来醛固酮与梅尼埃病相关性的研究值得重视，这对预防眩晕发作，控制发作症状有着重要的意义。本研究表明，分别利用血管加压素和醛固酮皆可成功诱发并建立双耳内耳膜迷路积水的动物模型，证实这两种激素参与内淋巴积水的形成，注射醛固酮组成功率89.4%（17/19），注射血管加压素组成功率73.7%（14/19），成功率在药物组间有显著性差异P＜0.05。两组间死亡率相同。药物组耳蜗积水程度重度21%（8/38），中度47.3%（18/ 38），轻度31.5%（12/38）。

一般认为，梅尼埃病病因不明，其病理变化的形成机制与内淋巴产生过多或吸收障碍有关。由于内淋巴液在内淋巴囊中吸收，推测内淋巴囊功能受损，可以导致内耳膜迷路积水。1965年，Kimura和Schuknecht［3，4］以此为据，首先报道通过手术破坏内淋巴囊和内淋巴管的方法，成功建立豚鼠内耳膜迷路积水的动物模型，此后大量的实验证明是接近梅尼埃病临床的动物模型，作为传统方法被一直采用。用同样的方法建模，Kimura早期报告建立单耳膜迷路积水模型的成功率或致病率为97%，以后报告成功率或致病率皆为100%，建模的成功率与建模者的经验及操作技术有关，此方法是有效的建模手段。但在实验建模的过程中，动物的死亡率及死亡原因一直未曾关注，由于此方法为切开硬脑膜，在硬脑膜内建模，动物有合并死亡率的风险，或可能牺牲更多动物生命。

在我们的早期研究中，皆采用Kimura方法进行单耳建模，虽然建模成功率能达到100%［7］，动物死亡率60%以上，消耗大量动物，其主要原因包括术中乙状窦致命性出血、小脑等结构损伤；术后窒息、颅内血肿、感染等。1989年，Andrews和Bohmer等人［14］对Kimura实验建模方法进行改良，通过硬膜外的方法手术破坏内淋巴囊和内淋巴管，诱发豚鼠内耳膜迷路积水，降低了动物的死亡率。2010年，Megerian等人［15］对此方法进行规范化操作示范。本研究中，我们选用改良Kimura硬膜外建模方法，在良好实验条件下进行建模，包括1）动物麻醉苏醒过程保暖，气道吸痰；2）在显微镜下使用电钻操作，避免脑膜穿孔和周围组织损伤；3）配用电凝器，暴露乙状窦后预先电凝，避免术中损伤后再用骨蜡止血，减少术中出血、术后硬膜外血肿的机会；4）单独喂养到伤口愈合，避免动物同类间互食。单侧手术1月后成功建模，动物死亡率为15%（3/20），原因和麻醉后窒息、颅内感染有关；双侧手术1月后成功建模，动物死亡率为75% （15/20），原因除和麻醉后窒息、颅内感染有关外，主要和模型动物进食困难有关。死亡率两组之间有显著差异。手术组总死亡率为45%（18/40），药物组总死亡率为5%（2/40），有显著性差异P＜0.01，因此，除非特殊实验设计，即使是有手术经验的研究人员，尽量避免双侧手术建模。手术组耳蜗积水程度重度90.9%（20/22），中度18.1%（4/22），膜迷路积水从顶转开始，和药物组不同，两组不同的原因将在以后进一步详细探讨分析。

在未来广泛而深入的研究中，膜迷路积水的动物模型不仅重要而且是基础，通过手术的方法，建立单耳膜迷路积水模型，研究内淋巴循环障碍导致膜迷路积水的可能机制，探寻内淋巴囊减压术的可能证据；通过醛固酮、血管加压素等药物方法，建立双耳膜迷路积水模型，研究内分泌代谢因素在膜迷路积水的可能机制中扮演的角色。研究分享建模经验不仅可以节约研究成本、珍惜动物生命，还可以提高建模效率和研究结论的科学性、准确性，从而推动内耳病的研究。

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3Kimura R，Schuknecht H.Membranous hydrops in the inner ear of the guinea pig after obliteration of the endolymphatic sac.PractOtolaryngol.1965；27：343-354.

4Kimura RS.Experimental blockage of the endolymphatic duct and sac and its effect on the inner ear of the guinea pig.A study on endolymphatic hydrops.Ann OtolRhinolLaryngol.1967；76（3）：664-687.

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8李华，陈贞君，方嘉阳：良性阵发性位置性眩晕1120例手法复位治疗复发率分析.内科急危重症杂志2012，18（3）：171-172.

9Korres S，Balatsouras DG，Kaberos A，Economou C，Kandiloros D，Ferekidis E：Occurrence of semicircular canal involvement in benign paroxysmal positional vertigo.Otology&neurotology：official publication of the American Otological Society，American Neurotology Society［and］European Academy of Otology and Neurotology 2002，23（6）：926-932.

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13Mandala M，Santoro GP，Asprella Libonati G，Casani AP，Faralli M，Giannoni B，Gufoni M，Marcelli V，Marchetti P，Pepponi E et al： Double-blind randomized trial on short-term efficacy of the Semont maneuver for the treatment of posterior canal benign paroxysmal positional vertigo.Journal of neurology 2012，259（5）：882-885.

14Parnes LS，Agrawal SK，Atlas J：Diagnosis and management of benign paroxysmal positional vertigo（BPPV）.CMAJ：Canadian Medical Association journal=journal de l'Association medicale canadienne 2003，169（7）：681-693.

15田颖，张涛，姜学钧：318例良性阵发性位置性眩晕的诊治分析.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志2012，26（1）：13-15.

16Nunez RA，Cass SP，Furman JM：Short-and long-term outcomes of canalith repositioning for benign paroxysmal positional vertigo.Otolaryngology--head and neck surgery：official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery 2000，122（5）：647-652.

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18孙良颖：良性位置性眩晕手法复位治疗的复发探讨.求医问药（学术版）2013（4）.

19章燕幸，吴承龙，肖桂荣，钟芳芳：后半规管良性阵发性位置性眩晕三种自我治疗手法的疗效比较.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2012，47（010）：799-803.

Acomparative study of guinea pig models of endolymphatic hydrops

JIANG Zidong1，GAO Fan2，SUN Chengcheng1
1 Department of Otorhinolaryngology，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100730，China
2 Department of otorhinolaryngology，Capital Institute of Pediatrics Affiliated Children's Hospital，Beijing 100020，China Corresponding author：JIANG ZidongEmail：zidongjiangcn@aliyun.com

Objective To compare several approaches to establishing guinea pig models of endolymphatic hydrops.Methods Eighty guinea pigs were divided into four groups(20 each)to undergo single ear modeling,binaural modeling,aldosterone injection or vasopressin injection.Collodion and frozen sections of the inner ear were collected from surviving animals and examined under an optical microscope.The rates of animal survival and successful modeling,characteristics of cochlear hydrops,and effects of frozen or collodion sections on microscopic image studies were studied.Results Both monaural and binaural modeling was successful in all attempted animals(24/24),although the mortality rate was 15%(3/20)for monaural modeling and 75%(15/20)for binaural modeling(P<0.05).The successful modeling rate was 89.4%(17/19)for aldosterone injection and 73.7%(14/19)for vasopressin injection,with a mortality of 5%(1/20)in both injection groups (P<0.05).Total mortality rate in surgical models was 45%(18/40),higher than injection models(5%or 2/40) (P<0.01).In surgical modeling groups,endolymphatic hydrops in cochlea was rated profound in 20(83.3%) and moderate in 4(16.6%)of the 24 surviving animals,while hydrops in injection modeling groups was profound in 8(21%),moderate in 18(47.3%)and mild in 12(31.5%)of the 38 surviving animals,respectively. Both frozen and collodion sections yielded similar microscopy results.Conclusions Methods for endolymphatic hydrops animal models should be selected according to the specific requirements of the experimental design to save cost and improve study efficacy.

endolymphatic hydrops；guinea pig；model

·临床研究·

R764.33

A

1672-2922（2015）04-742-6

2015-12-14审核人：吴子明）

基

DO金I：项10目.3：9国69家/j自.is然sn基.1金672-2922.2015.04.043NSFC-81441032，北京协和医院中青年基金

蒋子栋，博士，主任医生，研究方向：眩晕疾病诊治和基础研究

蒋子栋，Email：zidongjiangcn@aliyun.com