HBV-DNA定量检测在乙型病毒性肝炎诊断中的临床价值

2015-09-13王德麟吴月平南通市第三人民医院检验科江苏226006

交通医学 2015年2期

王德麟，吴月平（南通市第三人民医院检验科，江苏226006）

王德麟，吴月平
（南通市第三人民医院检验科，江苏226006）

目的：探讨荧光定量PCR检测HBV-DNA在乙型病毒性肝炎诊断中的临床价值。方法：乙型肝炎患者180例为观察组，另选体检健康者300例为对照组，两组均行血清HBV-DNA检测，同时将检测结果与酶联免疫吸附试验测定的乙肝血清标志物进行对比分析。结果：HBsAg+HBeAg+HBcAb+阳性率最高达98.0%，其病毒拷贝数为6.25±1.72copies/mL，也显著高于其它组（P<0.01）；急性乙肝HBV-DNA阳性为85.7%，显著高于其它组（P<0.01）；病毒拷贝数为6.25±1.72copies/mL，均明显高于其他疾病（P<0.01）。结论：荧光定量PCR方法检测HBV-DNA可准确判断乙型肝炎病毒的复制能力和传染性，从而为临床治疗提供更多依据。

乙型病毒性肝炎；聚合酶链反应；酶联免疫吸附试验；乙肝血清标志物；病毒拷贝数

乙型肝炎是一种常见的肝脏病毒感染性疾病，具有很强的传染性，并且病情发展快、治疗难度大，可引起肝腹水、肝硬化等严重后果。据资料显示，目前全球约有超过3亿的乙型肝炎病毒携带者，我国每年约有超过60万的患者死于急性或慢性乙肝。因此，有效的诊断和治疗对于提高疗效和改善患者预后有着非常积极的意义[1-4]。收集我院2013年10月—2014年9月诊治乙型肝炎患者180例血液标本，应用荧光定量PCR检测HBV-DNA，现就结果分析报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料乙型肝炎患者180例为观察组，其中男94例，女86例，年龄25~70岁，平均（42.42± 10.17）岁。另选同期体检健康者300例为对照组，其中男165例，女135例，年龄24~70岁，平均（42.55±

10.62）岁，均为乙型肝炎病毒阴性。两组年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2方法（1）仪器和试剂：ABI7500核酸检测仪（美国ABI公司），试剂盒（上海科华生物制品有限公司，批号：14090111）；WELLSCAN K3酶标仪，试剂（厦门英科新创科技有限公司，批号分别为HBsAg2 014095124、HBsAb2014095214、HBeAg2014115317、HBeAb2014095412和HBcAb2014095514）。两组均用荧光定量PCR进行血清HBV-DNA检测，同时使用酶联免疫吸附试验对其乙肝血清标志物进行测定，并对两种方式检测结果进行对比分析。（2）荧光定量PCR检测步骤：通过碱裂解法从血清中提取HBV-DNA，先采集3μL作为反应模板。将27μL预混好的PCR反应液（反应液主要由酶、dNTP、引物、缓冲液等制成）加入混合，同时设置阴性和阳性对照。在50℃环境下预热2min后，按94℃2 min，94℃10s，60℃35s进行40个循环。根据标准品建立的标准曲线，通过软件计算出样本中DNA含量。（3）酶联免疫吸附试验步骤：使用酶联免疫法测定血清中HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb表达情况，同时设置阴阳性对照。（4）HBV-DNA阳性判定标准：拷贝数＞1.0×103copies/mL时，表明病毒数量较多，具有较强的传染力；拷贝数＜1.0×103copies/ mL时，表明病毒数量较少，传染力较弱[5]。

1.3统计学处理运用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料采用（±s）表示，差异性比较应用配对t检验；计数资料差异性比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

荧光定量PCR检测结果见表1，患者中HBsAg+ HBeAg+HBcAb阳性率最高，且其病毒拷贝数亦显著高于其它组（P<0.01）；通过比较不同疾病类型HBV-DNA检测结果见表2，HBV-DNA阳性率与不同疾病类型无明显关系，但急性乙肝病毒拷贝数均明显高于其他疾病（P<0.01）。

表1　血清学标志物组合乙型肝炎病毒检测结果（例，（±s）

与HBsAg+HBeAg+HBcAb阳性组比较，*P＜0．01

组合类型例数HBV-DNA阳性HBV-DNA拷贝数（copies/mL）例数阳性率（%）HBsAg+HBeAg+ HBcAb+504998.06.25±1.72血清学标志物HBsAg+HbeAb+ HBcAb+501326.05.00±1.17*HBsAg+HBcAb+5048.04.05±0.81*HBsAg+HBeAg+15426.72.21±0.81*HbeAb+HBcAb+15213.31.12±0.12*对照组30051.671.02±0.19*合计4807716.04

表2　不同疾病乙型肝炎病毒检测结果（例，%，±s）

与急性乙肝组比较，*P＜0.01

疾病类型例数HBV-DNA阳性HBV-DNA拷贝数（copies/mL）例数阳性率（%）慢性乙肝852023.55.11±0.88*急性乙肝353085.76.25±1.72肝癌15746.73.99±0.88*肝硬化201260.05.98±1.18*无症状携带者25312.04.95±0.71*合计1807240.0乙型肝炎

3　讨论

荧光定量PCR检测HBV-DNA的方法，是临床诊断实验室近年来引入的新的检测乙型肝炎的指标，属于分子生物学范畴。该技术在PCR的基础上引入了一条双标记的核酸荧光探针。如果出现解链的乙型肝炎病毒核酸序列，就会引起荧光信号的改变,通过荧光强弱来确定病毒的含量，显著提高了检测的特异性[10]。同时，荧光定量PCR检测全程闭管，有效的避免了传统PCR后观察和操作过程引起交叉污染和假阳性结果，从而提高了检测的准确性[6-7]。

乙肝血清标志物的任何一种表达模式均能够检测到乙肝病毒DNA，但不同表达模式间阳性率存在较大差异。其中HBsAg、HBeAg、HBcAb标志物组合阳性率最高，说明在急性感染期病毒复制非常活跃。HBeAg转阴而HBeAb阳性可以判定病情稳定，且处于好转，这部分患者的病毒复制量较急性期有所下降，但仍然具有一定的传染性。另外几组标志物则表明在急性乙肝恢复期患者和慢性乙肝携带者，病毒复制量较低，传染性相对较小；在急性乙肝感染早期，传染性相对较强[8-9]。

通过表2发现，急性乙肝病毒拷贝数均明显高于其他疾病（P<0.05）；肝癌、肝硬化的患者乙肝病毒DNA阳性率较高。在肝癌早期病毒复制比较活跃，破坏肝脏细胞，导致肝脏纤维化加重；晚期以后病毒复制活动相对减少。

在本次研究中，对照组的300例血清标志物全阴性的患者也出现了5例乙肝病毒DNA阳性，分析其原因可能是这部分患者处于乙型肝炎病毒感染的“窗口期”；另外可能是由于血清标志物含量较少，酶联免疫反应无法检测。由此提示，即使患者血清标志物全阴性也可能存在乙肝感染，因此荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA，在乙肝的早期诊断中有酶联免疫吸附法不具备的优势。但是表1显示，HBsAg、HBeAg、HBcAb血清学标志物组合有少量的阴性病例，其余血清学标志组合中也存在HBV-DNA阴性的病例。若单独HBV-DNA并不能完全反映机体对乙型肝炎抗原抗体的携带情况，因此临床上通常联合检测HBV-DNA和乙肝两对半来综合判断乙肝患者的病毒感染和复制情况[10]。

荧光定量PCR检测乙型病毒性肝炎的方法，能够准确的判断乙肝患者体内病毒的复制能力和传染性。不仅能够准确判断乙型肝炎病毒是否存在，同时也可以将病毒的复制情况和拷贝数准确的反映出来。它具有省时，费用相对较低的优点，目前也正在临床上广泛应用[10]，具有非常重要的临床价值。

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