雷帕霉素对肝脏缺血再灌注大鼠Beclin-1、Lc-3蛋白表达及细胞凋亡的影响

王国强 刘洪珍 杨承祥 文先杰 赵伟成

(江苏省麻醉学重点实验室 江苏省麻醉与镇痛应用技术重点实验室，江苏 苏州 221004)

雷帕霉素(RAPA)是一类新型免疫抑制剂，可提高移植物的长期存活率。目前研究发现，RAPA可激活自噬系统，抑制肾小管上皮细胞再生，延迟移植肾功能恢复时间等〔1，2〕。但RAPA减轻肝脏缺血再灌注损伤的研究相对较少。本文拟探究RAPA是否能够减缓肝脏缺血再灌注后肝细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择健康清洁型SD大鼠(雌雄不限)36只，体质量200～220 g(购自江苏省麻醉学重点实验室)，适应性喂养1 w后开始试验。将大鼠随机分为假手术组(A组)、手术组(B组)和雷帕霉素组(C组)。

1.2 建立动物模型〔3〕术前6～8 h禁食，自由饮水，A组行麻醉、剖腹，解剖肝门，不阻断血供。B组在A组基础上，分离左、中肝叶各韧带，使肝脏充分暴露，使左、中肝叶的胆管及门静脉、肝动脉分支游离。用血管夹钳夹后造成左、中叶肝脏缺血，麻醉后夹闭大鼠左半肝血供90 min，被阻断区肝叶由鲜红变为暗红判定肝脏缺血成功，恢复血供后再灌注60 min，造成肝脏缺血再灌注模型。C组同样行A组步骤后，在肝脏缺血前5 min经肠系膜上静脉缓慢注射治疗剂量RAPA 5 mg/kg(A组和B组缓注等剂量的生理盐水)。各组均于再灌注3、6、12、15 h后，取大鼠尾静脉血检测肝脏功能的变化，并取缺血肝叶标本，设定再灌注后0、3、6、12 h为检测结点，每次检测3只，固定于甲醛溶液用于病理学检测。

1.3 检测指标 Beclin-1、Lc-3蛋白表达:取各组肝脏组织，应用Beclin-1鼠抗人试剂盒、Lc-3兔抗人多克隆抗体试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，按试剂盒说明操作，采用PV法进行检测;请2位高年资病理科医师阅片。Beclin-1蛋白多为细胞质内表达，Lc-3蛋白仅在细胞质内表达。血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)含量用常规生化方法检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0软件。计量资料以±s表示，组间比较应用方差分析。

2 结果

2.1 各组Beclin-1、Lc-3蛋白表达情况 Beclin-1蛋白表达高峰为缺血再灌注后3 h，Lc-3峰值为缺血再灌注后6 h，见表1。2.2 各组ALT、AST变化情况 ALT、AST峰值时间均在缺血再灌注后12 h，见表2。

表1 各组Beclin-1、Lc-3蛋白表达阳性率(%，n=3)

表2 各组ALT、AST变化情况(±s，n=3，IU/L)

表2 各组ALT、AST变化情况(±s，n=3，IU/L)

与同组不同时段比较:1)P＜0.05;与B组比较:2)P＜0.05

组别ALT AST 3 h 6 h 12 h 15 h A组 42.34±4.3182.34±4.77119.34±5.3579.34±8.29101.22±3.41180.66±8.38221.13±2.72182.3 h 6 h 12 h 15 h 41±5.91 B组 139.37±5.83147.64±2.99258.38±9.211) 150.38±8.14457.20±5.33527.20±9.01599.20±3.521) 511.42±6.46 C组 56.32±5.2498.02±7.1999.02±7.191)2) 99.01±6.88302.45±1.92355.91±5.55371.22±8.361)2)331.71±9.83

3 讨论

肝脏缺血再灌注涉及肝脏创伤手术修复、器官移植、移植后功能恢复等诸多问题，一直以来都是人们研究的热点〔4〕。血清ALT和AST水平是反映肝损伤程度最为灵敏的指标〔5〕。随着人们研究的不断深入，RAPA与细胞自噬对肝脏缺血再灌注损伤的相关研究开始进入人们的视野。目前已知Lc-3和Beclin-1均为自噬相关基因，可参与自噬体形成，其中Lc-3已作为检测自噬活性的标记性分子〔6〕。

本研究结果证实，缺血再灌注会对肝脏造成一定程度的损伤，而RAPA对肝脏缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，与徐倩等〔7〕的研究结果相似。

综上，RAPA可有效改善肝缺血再灌注损伤，但其确切机制有待更深入研究。

1 余 曦，张 莹，范 伟，等.雷帕霉素对肝脏缺血再灌注中线粒体DNA损伤及修复机制的影响〔J〕.第三军医大学学报，2014;31(21):2191-5.

2 肖堂利，孙 蕾，管 旭，等.雷帕霉素对糖尿病肾病小鼠足细胞自噬的改善作用〔J〕.第三军医大学学报，2013;30(23):2530-5.

3 陈广顺，司中洲，李杰群，等.雷帕霉素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.西安交通大学学报(医学版)，2014;1(1):85-8.

4 Afzal M，Intelligent I，Kaur P，et al.Comparison protective and curative potential of daucus carol root extract on plans expertise ischemia reperfusion injury in rats〔J〕.Pharm Biol，2013;51(7):856-62.

5 元文勇，余伟平，叶启发，等.大鼠肝脏缺血再灌注损伤程度判定指标的选择〔J〕.中国普通外科杂志，2008;17(7):650-3.

6 眭怡群，冯一中.自噬相关基因 LC3、Beclin-1与凋亡相关基因 p53、BCL-2在大肠癌中的表达及意义〔J〕.临床与实验病理学杂志，2012;28(3):392-401.

7 徐 倩，杜洪印，喻文立，等.雷帕霉素对大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.天津医科大学学报，2014;(3):181-3.