姜黄素及谷胱甘肽对阿霉素所致大鼠急性心肌损伤的保护作用

卢均坤 吕维娟 刘 洋 王燕琴 (佳木斯大学附属第一医院心内科，黑龙江 佳木斯 54002)

蒽环类抗生素是有效的抗肿瘤药物，然而会对正常的组织造成损害。尤其是剂量依赖性的急性和延迟心肌损伤，在心肌损伤的病人中约有20%可引起充血性心力衰竭〔1〕。核转录因子-κB(NF-κB)广泛地调控着一系列基因的表达，尤其是调节参与免疫反应、应激反应、炎症反应和凋亡等相关因子的基因表达〔2〕。姜黄素是一种天然的NF-κB抑制剂，能够保护间充质干细胞免受炎性细胞因子损害，姜黄素具有抑制多种炎症因子的作用，谷胱甘肽可通过一些酶系，抑制脂质过氧化作用的启动和终止脂质过氧化的发展，从而阻断新自由基的产生〔3〕。本实验探索阿霉素心肌损伤的机制及预防机制。

1 材料和方法

1.1 动物和试剂 健康12 w龄左右Wistar大鼠60只，雌雄不限，体重(250±28)g，由佳木斯大学实验动物中心提供〔许可证号为SCXK(黑)2007－0001〕。阿霉素由浙江海正药业有限公司生产，姜黄素由陕西森弗生物技术有限公司;谷胱甘肽购自上海复旦复华药业有限公司;心肌酶检测试剂盒、免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物分组 60只Wistar大鼠，随机分为三组，每组20只，设空白对照组正常饲喂，腹腔注射等量生理盐水。实验组，按照1.25 mg/kg剂量腹腔注射阿霉素，隔日一次共计7次，累积剂量7.5 mg/kg。姜黄素谷胱甘肽干预组，阿霉素腹腔给药同实验组，但在化疗前4 d开始给予姜黄素及谷胱甘肽鼠尾静脉给予，每日一次，直到化疗结束。

1.3 标本收集 所有实验大鼠，实验结束后摘除眼球方法取血，在4℃，3000 r/min离心后取上清液，备用。留取大鼠左心室心脏标本2%戊二醛及4%本甲醛固定，备用。

1.4 试验方法

1.4.1 一般情况检测 观察大鼠的一般精神状况，饮食，皮毛和体重情况等。

1.4.2 血清心肌酶检测 酶联免疫吸附法测定，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 组织病理学检查 心肌组织4%甲醛固定24 h后以石蜡包埋，切成5 μm左右薄片，用HE进行染色，显微镜观察心肌组织病变，以肿胀肥大程度及胞质空泡变性程度来判定。

1.4.4 电镜检查 取左心室心肌部组织，2%戊二醛固定，1%锇酸后固定，Epon812包埋、切片至70～80 nm，铅铀电子染色，电镜观察线粒体结构。

1.4.5 免疫组化检查 NF-κB、IκB均采用按试剂盒说明书进行操作:取4 μm厚10%甲醛固定的石蜡切片，常规脱蜡水化，浸入3%过氧化氢(H2O2)5 min，PBS冲洗3次，滴加稀释的一抗(NF-κB P65单克隆抗体和IκBα多克隆抗体均为 1∶50稀释度)，滴加适量兔抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，DAB显色。乙醇脱水，透明树胶封片。心肌间质细胞及细胞核内染色强度评分:未着色、浅黄色、黄色、棕黄色分别计为0、1、2、3分;阳性细胞数为 ＞25%、25% ～50%、50% ～75%、＞75%分别计为0、1、2、3分;两者之和 ＞2即为免疫组化阳性，计算阳性百分率。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行q检验。

2 结果

2.1 大鼠的一般状况 空白对照组大鼠摄食、活动、粪便等一般状况良好，体重增长较快，皮毛光滑;阿霉素组大鼠出现进食明显减少、腹泻，活动迟缓、体重增长缓慢、皮毛不光滑;姜黄素谷胱甘肽干预组较阿霉素组大鼠进食量增多，活动性较好，体重增长稍慢，皮毛不光滑。

2.2 心肌酶学变化 在三组大鼠中，阿霉素组血清心肌酶各指标明显高于空白对照组及姜黄素谷胱甘肽组(P＜0.05)，姜黄素谷胱甘肽组同空白对照组比较差异无显著意义(P＞0.05)，见表1。

2.3 心肌组织结构的病理学检查 空白对照组:心肌组织未见明显变性;阿霉素组:心肌组织结构紊乱，部分心肌细胞肥大肿胀明显，细胞内可见均匀的细小红染颗粒，并伴有水样变性;姜黄素及谷胱甘肽干预组:心肌组织少部分心肌细胞肿胀肥大，细胞轻度水样变性，见图1。

表1 各组大鼠血清心肌酶学变化(±s，n=20)

表1 各组大鼠血清心肌酶学变化(±s，n=20)

与阿霉素组比较:1)P＜0.05

组别 CK(U/L) CK-MB(U/L) TnI(μg/L) LDH(U/L) AST(U/L).5437.5±32.8阿霉素组 768.6±137.5889.2±147.50.82±0.071 473.6±334.5815.4±102.4姜黄素谷胱甘肽组 523.7±131.81) 584.3±135.41) 0.41±0.061) 936.8±137.21) 523.6±95.71)空白对照组 467.4±124.3526.3±137.60.36±0.04842.3±94

2.4 线粒体电镜检查 电镜检查发现空白对照组大鼠心肌线粒体排列整齐、皱褶比较多、峭完整;阿霉素组大鼠心肌线粒体增生、排列紊乱、肿胀、畸形，峭减少、肌浆网扩张、空泡化明显;姜黄素谷胱甘肽干预组大鼠心肌线粒体增生、排列紊乱、肿胀程度较单纯阿霉素明显减轻、嵴较单纯阿霉素组增多、有少量空泡变性，见图2。

2.5 免疫组化检查 在各组大鼠心脏组织中NF-κB蛋白的表达与IκB蛋白的表达的相关分析发现，空白对照组大鼠心肌细胞有少量NF-κB蛋白表达和较多IκB蛋白表达;阿霉素组大鼠中NF-κB蛋白表达阳性率明显升高，IκB蛋白表达明显下降;在姜黄素谷胱甘肽组表达较阿霉素组NF-IκB蛋白表达明显降低、IκB蛋白显著增加(P＜0.05)，同空白对照组比较差别无显著意义(P＞0.05)，见表2。

图1 各组大鼠心肌组织病理学检查(HE，×200)

图2 各组大鼠心肌线粒体电镜检查(×9000)

表2 NF-κB/IκB在大鼠心肌中的表达(%，±s，n=20)

表2 NF-κB/IκB在大鼠心肌中的表达(%，±s，n=20)

与阿霉素组比较:1)P＜0.05

组别 NF-κB IκB 6.06±0.4842.08±6.26阿霉素组 47.34±1.0511.29±1.17姜黄素谷胱甘肽组 12.17±0.541) 35.23±7.041)空白对照组

3 讨论

蒽环类药物属于抗生素类药物，抑制恶性肿瘤的作用是通过插入DNA双链、抑制拓扑异构酶Ⅱ和细胞凋亡的方式起作用的〔4〕。在临床治疗中重复使用蒽环类药物会导致顽固性心律失常，心脏扩大，顽固性心力衰竭，传统的抗心衰治疗往往无效，严重地影响到肿瘤患者的5年生存率和生活质量，从而限制了蒽环类药物在临床的广泛使用。

姜黄素是植物姜黄提取的酚类化合物，经常被用作调味品及食物染色剂，研究发现姜黄素具有抗炎抗氧化作用〔5〕，同时姜黄素具有抗肿瘤作用，可使癌细胞凋亡。阿霉素具有强大的诱生自由基作用，通过电子与氧分子结合形成活性氧，减少NADH脱氢酶，形成半鲲结构化合物，促使心肌线粒体氧化还原反应，正常情况下，人体可以通过超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(GR)和GSH及时清除或还原自由基及其超氧化物，这些酶在清除自由基、抗脂质过氧化中具有重要作用。而阿霉素可使这些酶减少，活性降低〔6〕。GSH通过一些酶系抑制脂质过氧化作用的启动和终止脂质过氧化的发展，从而阻断新自由基的产生。姜黄素联合谷胱甘肽干预大鼠阿霉素心肌损伤具有显著作用，线粒体变性可能是阿霉素心肌损害的始动因素，有待于进一步研究。

有研究表明阿霉素心肌毒性早期引起线粒体超氧化反应和其他活性氧的产生，通过一系列氧化还原反应产生NO和活性氮，随后引起NF-κB和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达增加〔7〕，阿霉素还可通过上调氧化还原敏感的转录因子如p53和NF-κB，改变了心肌线粒体通透性，增加心肌细胞凋亡，最终引起心脏毒性。在本实验中说明阿霉素引起NF-k表达增加，NF-κB是由p50和p65亚基组成的异源二聚体，正常情况下它在胞质中与其抑制蛋白IκB结合而呈非活性状态。当细胞受到各种刺激原作用时，NF-κB与其抑制蛋白IκB解离而激活，进入细胞核内与特定基因启动子结合，调节靶基因表达。近年研究发现，iNOS基因5'端转录调控区域中含有NF-κB结合位点，NF-κB激活参与iNOS mRNA表达〔8〕，iNOS和NO过氧化反应是阿霉素心脏毒性及心肌细胞凋亡的触发点和介质，当细胞受到各种刺激后，NF-κB即被活化，并很快异位到核与靶基因启动子区域κB基序结合，启动基因的转录和蛋白合成，调节基因的表达。徐浩等〔9〕研究表明，NF-κB在阿霉素致大鼠心肌组织细胞损伤过程中起促进细胞凋亡的作用，可能与其调节凋亡相关基因p53的表达有关。Buhrmann等〔10〕研究发现发现，在体外培养的跟腱细胞感染模型中，姜黄素能通过抑制IκBα磷酸化及降解，抑制在IL-1β诱导的NF-κB激活。本研究结果显示，在正常大鼠心肌组织中NF-κB有少量表达，可能是正常心肌组织NF-κB维持正常的心肌生理功能，调节正常心肌组织。姜黄素、谷胱甘肽对人体没有毒性作用，可以用来保护恶性肿瘤病人在应用阿霉素化疗时，减轻心脏损害。

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7 Mukhopadhyay P，Rajesh M，Batkai S，et al.Role of superoxide，nitric oxide，and peroxynitrite in doxorubicin-induced cell death in vivo and in vitro〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009;296(5):H1466-83.

8 Cooke CL Davidge ST.Peroxynitrite increases iN0s through NF-kappaB and decrease spotacyclin synthase in endothelial cells〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol，2002;282(2):c395-c402.

9 徐 浩，李红莉，周国伟，等.核因子-KB在阿霉素致大鼠心肌细胞损伤中的意义〔J〕.实用诊断与治疗杂志，2008;22(4):258-63.

10 Buhrmann C，Mobasheri A，Busch F，et al.Curcumin modulates nuclear factor κB(NF-κB)-mediated inflammation in human tenocytes in vitro〔J〕.J Biol Chem，2011;286(32):28556-66.