茵陈蒿汤对梗阻性黄疸大鼠多药耐药相关蛋白表达的影响及意义

李晓峰 于 昆 戴 勇 秦 伟 杨生虎 党宝宝 韩 云 杨立平 董 晋

(青海大学附属医院腹部腔镜外科，青海 西宁 810000)

胆红素主要因子多药耐药相关蛋白2(MRP2)基因是近年来新发现的三磷酸腺苷结合运载体家族成员，其主要表达于肝细胞基底膜并与胆红素分泌密切相关〔1〕。MRP2基因的缺失和突变可造成血液中结合胆红素大量堆积，诱发胆红素代谢障碍并导致肝细胞损伤。茵陈蒿汤是中医治疗黄疸的经典方剂，具有显著的保肝作用，但其作用机制尚未明确。本研究旨在为茵陈蒿汤治疗梗阻性黄疸(OJ)提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄清洁级雄性SD大鼠50只，来源于中国科学院啮齿类动物中心上海分中心，第3代，购于青海省地方病预防控制所，平均体重(201±18.75)g，饲养于青海大学附属医院动物实验室，单笼喂养，室内温度19℃ ～23℃。

1.2 材料 取茵陈蒿汤(茵陈30 g、栀子15 g、大黄10 g)，采用中药煎制浓缩法:水煎法，每次均先武火后文火煎煮，上药加水10倍量，浸泡2 h，煎煮30 min，滤过取汁，药渣加水8倍量，煎煮1 h，滤过取汁，合煎煮30 min，滤过取汁，药渣加水8倍量，煎煮1 h，滤过取汁，合并2次药汁混合，过滤，浓缩为120 ml，4℃保存备用。

主要试剂:Tripure试剂(美国SIGMA公司)，MRP2一抗〔兔抗鼠多克隆抗体血清(EAG15)，免疫荧光检查时稀释为1∶200〕，RTPCR 试剂盒(PRO-megaCompany)，MRP2 扩增的上下游引物、内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)扩增的上下游引物(上海基康公司)，正常山羊血清、焦碳酸二乙酯(DEPC)水、FTI℃山羊抗兔荧光二抗(武汉博士德生物有限公司)，丙酮异丙醇、氯仿、石蜡等(上海化学试剂公司)。

1.3 方法

1.3.1 分组 将50只大鼠按照随机化原则，随机抽出10只作为假手术(SHAM)组，其余40只作为OJ组，造模后将OJ组随即平均分为OJ实验组和OJ对照组。所有SD大鼠均给予普通饲料喂养。按动物体表面积比率换算等效剂量法计算出予以中药的剂量，OJ实验组大鼠给予1 ml/100 g茵陈蒿汤灌胃，OJ对照组大鼠用生理盐水以同样方法灌胃，持续用药2 w。

1.3.2 OJ模型的建立 OJ组大鼠以25%乌拉坦溶液行腹腔内注射麻醉，麻醉成功后，行大鼠腹部皮肤常规消毒，取腹部正中切口，暴露胆总管，距其起始部位0.5 cm处游离胆总管，以3-0号线双重结扎并切断，关腹。假手术组仅游离胆总管，不作结扎处理。术后8～12 h后口饲补液，1 d后自由进食，保证充足饮水。

1.3.3 标本的采集与处理 25%乌拉坦溶液按1 g/kg腹腔内注射麻醉，麻醉成功后，取腹部正中切口打开腹腔，观察大体形态，肝脏的色质，清除大鼠自然生长而产生的差异。开腹后经下腔静脉采血3～5 ml，冰浴，离心15 min(4℃，3000 r/min)，取上清置于－70℃保存待测;摘取肝脏后，从肝右叶切取1.0×0.8×0.3 cm3大小肝组织，置10%甲醛固定，逐级梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

1.3.4 血样采集及保存 将大鼠麻醉后，腹主动脉采血约4～5 ml，二钾盐抗凝管离心后取血浆，超低温冰箱－70℃保存。生化分析仪检测血清谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TB)、总胆汁酸(TBA)。

1.3.5 肝组织MRP2转运蛋白检测 (1)石蜡保存的肝脏标本行4 μm 厚切片(先 10 μm 粗切，后 4 μm 细切)，载玻片捞片;(2)切片脱蜡水化:二甲苯脱水各5 min，无水酒精、95%、90%、80%酒精依次梯度脱水5 min;(3)室温放置30 min，用20℃丙酮固定10 min，自然风干;(4)用缓冲液冲洗，5 min×3次，每间隔5 min/次;(5)先封闭，用正常山羊血清磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，室温孵育20 min，弃去血清，置于室温编号入湿盒;(6)以正常山羊血清PBS、一抗(1∶200)稀释液封闭，4℃孵育冰箱过夜;(7)次日用PBS冲洗，5 min×3次，未结合的抗体用0.01 mol/L，pH7.2的PBS轻震荡洗涤，10 min×2次;(8)以下步骤避光，加封闭液稀释的山羊抗兔荧光二抗，室温下孵育30～60 min;(9)PBS冲洗，5 min×3次，最后用蒸馏水冲洗1次，自然风干;(10)甘油PBS封片，镜检;(11)CMIA图像分析仪测定MRP2表达以相对灰度值表示。阳性判定标准:深黄色或棕黄色为强阳性()，黄色为阳性()，浅黄色为弱阳性(+)，与背景同色者为阴性(-)。用医学图文系统分析，每张切片随机选取5个视野，测定MRP2阳性纤维的平均光密度，灰度值越大，表示MRP2的含量越高。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结果

2.1 OJ大鼠肝脏病理学变化 OJ组大鼠肝血管充血，肝细胞肿胀，气球样变性，出现点状坏死，肝内胆管扩张，小叶周边可见新生小胆管样上皮细胞，以汇管区明显，有少量炎性细胞浸润。SHAM组病变较轻，未见明显差异。见图1。

2.2 茵陈蒿汤对OJ大鼠肝功能的影响 OJ实验组和OJ对照组中 AST、ALB、TB、TBA 均明显高于 SHAM 组(P＜0.05);而OJ实验组各指标均显著低于OJ对照组(P＜0.05)。见表1。

图1 各组大鼠肝脏病理学改变

表1 各组肝功能检查结果比较(±s，U/L)

表1 各组肝功能检查结果比较(±s，U/L)

与SHAM组比较:1)P＜0.05;与OJ实验组比较:2)P＜0.05

16 OJ实验组 20589.34±60.481) 15.16±2.161) 628.67±68.451) 691.56±30.821)OJ对照组 20736.52±40.821)2) 19.28±1.561)2) 765.35±32.691)2) 779.32±49.231)2)AST ALB TB TBA SHAM组 1031.52±3.128.02±1.5319.26±2.9415.06±2.组别 n

2.3 茵陈蒿汤对OJ大鼠肝组织MRP2蛋白表达阳性率的影响OJ实验组和OJ对照组肝组织MRP2的表达阳性率显著低于SHAM组(100%，+20%，30%，50%);而OJ实验组肝组织MRP2的表达阳性率(50%，+40%，10%)显著高于OJ对照组(30%，均为+)(P＜0.05)。

3 讨论

胆汁的形成、分泌和排泄机制非常复杂，胆汁酸是胆汁中的一种以K盐和Na盐的形式存在的胆烷酸。胆汁酸主要由胆固醇转化而来，在代谢过程中经过肝肠循环，在肠道有95%胆汁酸被重新吸收，经门静脉血流入肝脏，正常人体中的胆汁酸基本完全被肝脏摄取〔2〕。胆汁酸几乎是唯一可同时反映肝细胞合成功能及肝细胞损伤的血清学指标。正常人血中胆汁酸水平的升高必然导致肝细胞病变，在各种急慢性肝病中，胆汁酸的水平基本与病情表现保持平行。目前已知高胆汁酸血症引发肝细胞损害的机制包括:(1)高胆汁酸与高胆红素引发能量代谢改变，从而引发肝细胞损害;(2)OJ引起的代谢紊乱改变了正常肝脏的血流动力学，从而引起肝细胞受损;(3)OJ引起的高胆汁酸状态影响了呼吸链电子的传递;(4)OJ引起的高胆汁酸状态导致肝细胞内电解质Ca、Mg浓度变化，从而激发了蛋白激酶PKC导致细胞凋亡;(5)OJ的高胆汁酸作用导致肝脏KC细胞产生毒性作用，从而影响机体正常的免疫功能;(6)OJ的高胆汁酸引起肠源性内毒素血症，从而导致肝细胞损伤〔3〕。MRP2通过对胆红素与胆汁酸的调节，降低胆汁酸的水平，其可能机制是:(1)MRP2调节胆汁内一些具备生物活性的谷胱甘肽结合物以及葡萄糖醛酸与硫酸盐结合物的分泌，结合体内的高胆汁酸，降低胆汁酸浓度，保护肝脏细胞。(2)MRP2参与调整体内胆汁酸的重新分布，将胆汁酸转运到MRP2基因表达的细胞膜，起到类似屏障的作用。(3)MRP2调节胆汁分泌，从而保护肝细胞〔4〕。茵陈蒿汤是中医治疗黄疸的经典方剂，方由茵陈蒿、栀子、大黄三味药组成，方中用茵陈清热利湿，疏利肝胆为君;栀子清泄三焦湿热，并可退黄为臣;大黄通利大便，导热下行为佐，三药相配，使湿热之邪从二便排泄，湿去热除，则发黄自退〔5〕。现代药理学研究证实，茵陈蒿汤能维持肝细胞膜系统的稳定，中和可溶性细胞因子，防止肝脏细胞的纤维化和坏死，清除自由基，预防超氧化物阴离子引起的成纤维细胞的损伤，清除体内内毒素的自由基，降低血清内毒素水平，保护肝细胞膜，预防肝细胞坏死，促进肝细胞再生及保障肝细胞微循环，诱导肝脏酶系统对胆红素的摄取，松弛胆道括约肌，增加胆汁流量，加速胆汁排泄〔6〕。本实验结果提示OJ中存在胆汁酸代谢紊乱和肝细胞损害，而茵陈蒿汤灌胃处理可起到有效的保肝作用，降低OJ所致的胆汁酸代谢紊乱和肝细胞损害;并且，MRP2可能是通过调节胆汁酸代谢参与OJ发生与发展，而调节MRP2表达可能是茵陈蒿汤发挥治疗作用的主要机制。

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5 刘 莹，张会存，段 娜，等.茵陈蒿汤对高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪性肝炎的药效学观察〔J〕.中国实验方剂学杂志，2012;18(13):217-9.

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