金银花中绿原酸的双水相萃取及抗氧化能力研究

胡佳钦，向　福，2*，石长萍，吴　伟，方元平，2（.黄冈师范学院 生命科学学院，湖北 黄州 438000；2.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄州 438000；3.湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003）

金银花中绿原酸的双水相萃取及抗氧化能力研究

胡佳钦1，向福1，2*，石长萍1，吴伟2，3，方元平1，2
（1.黄冈师范学院 生命科学学院，湖北 黄州 438000；2.大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄州 438000；3.湖北理工学院 医学院，湖北 黄石 435003）

为合理利用大别山金银花资源，以罗田县的金银花及其茎、叶为试验材料，利用双水相体系萃取绿原酸，并研究了其抗氧化活性。结果表明：50 mL丙酮/磷酸氢二钾（K2HPO4）双水相体系萃取绿原酸的最佳条件为酮水比8.5∶1.5（V/V），磷酸氢二钾添加量3 g，水提液绿原酸质量浓度22.9 g/L。在此条件下，绿原酸含量为56.27%，收率为98.46%，且其绿原酸的羟基自由基清除能力较强，从而为大别山金银花资源的开发利用提供了理论依据。

双水相；金银花；绿原酸；羟基自由基清除；抗氧化活性

金银花（Lonicera japonica）药用历史悠久，是临床常用的中药之一，具有较高的使用价值［1］。绿原酸（ch1orogenic acid）是金银花的主要药效成分和评价成分，具有抗氧化、降血脂、降血糖、调节免疫、保护心脑血管的功能［2-5］。目前，从金银花中分离纯化绿原酸的主要方法有大孔树脂吸附法、水提石灰乳沉淀法、超滤法、正丁醇分离法、β-环糊精包埋法、水提醇沉法、石灰硫酸法、异戊醇法和改良的醋酸乙酯法等［6-10］，这些分离纯化方法存在绿原酸含量低、耗时长、操作繁琐、有机溶剂残存、环境不友好、生物相容性低等问题，难以适应工业化生产［11］。同时，绿原酸高温下不稳定，易失活。

双水相萃取（aqueous two-phase extraction，ATPE）是一种新型溶剂萃取的分离提纯技术，提取过程能有效保护天然产物的生物活性［12］，且有选择性强、易于放大的特点，适合大规模生产、操作简单、生物亲和性好、经济简便、快速高效且不存在有机溶剂残存问题［13-14］，有效提高了天然活性物质分离纯化的安全性和提取效率。

为便于产业化应用，本实验以罗田县的金银花及其茎叶为实验材料，基于酮水比、磷酸氢二钾加入量和水提液绿原酸质量浓度3个因素，探讨丙酮/K2HPO4双水相体系萃取绿原酸的最佳条件，并研究其抗氧化活性，从而为大别山金银花资源的开发利用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

金银花（花茎叶整株采收）：罗田县开发区金银花基地，阴干，粉碎备用；绿原酸标准品（纯度≥99%）：上海如吉生物科技有限公司；维生素C（vitaminC，VC）标准品（纯度≥99.99%）：上海麦克林生化科技有限公司；丙酮（分析纯）、磷酸氢二钾（分析纯）：天津凯通化学试剂有限公司；羟自由基清除能力测定试剂盒：北京索莱宝科技有限公司。

1.2仪器与设备

Varian Cary 100 Scan紫外可见分光光度计：美国Varian公司；Ax-205 METTLER TOLEDO电子天平：瑞士梅特勒-托利多集团；RE-4205旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DZKW-D-2电热恒温水浴锅：北京西城区医疗器械厂。1.3实验方法

1.3.1金银花水提液制备

根据参考文献［15］中提取绿原酸的方法，称取10 g金银花粉末，用体积分数60%乙醇按料液比1∶3.5（g∶mL）浸提过夜，再按料液比1∶20（g∶mL）的沸水，水浴搅拌10 min，冷却至室温抽滤，在70℃浓缩至50 mL左右，制得金银花水提液。

1.3.2绿原酸标准曲线的制作

准确称取绿原酸标准品10mg，用超纯水定容至100 mL，制得绿原酸标准溶液。取绿原酸标准溶液用紫外分光光度计于波长200～500 nm处扫描，确定检测波长为322 nm。

分别吸取绿原酸标准溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中定容，在波长322 nm处测定吸光度值。绿原酸在0.005～0.050 g/L质量浓度范围内与吸光度值呈良好的线性关系，回归方程为y=0.052 4x+0.003 8，相关系数R2=0.999 4。

1.3.3双水相体系萃取单因素试验

准确量取一定体积的金银花水提液置于50 mL锥形瓶中，按比例加入一定体积的丙酮和一定质量的磷酸氢二钾，振荡，使其充分混匀，静置过夜后分离上下两相，测体积计算相比R，并在波长322 nm处测其吸光度值，根据标准曲线线性回归方程计算绿原酸质量浓度和分配系数K。相比、分配系数和绿原酸收率的计算公式如下：

式中：R为相比；VA、VB分别为上、下相体积，mL；K为分配系数；CA、CB分别为上、下相中绿原酸质量浓度，g/L；Y为绿原酸收率，%。

1.3.4双水相体系萃取条件正交试验优化

在单因素试验基础上，对影响双水相萃取主要因素进行正交试验，以绿原酸收率Y为考察指标，确定50 mL双水相体系萃取绿原酸的最佳条件。正交试验因素与水平如表1所示。

表1　萃取条件优化正交试验因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.5抗氧化能力检测

分别配制绿原酸质量浓度为0.15g/L、0.30g/L、0.45 g/L、0.60 g/L和0.75 g/L的金银花水提液、上相萃取液、绿原酸标品溶液，并以相同质量浓度的VC作为阳性对照，参照说明书混匀后，在37℃温育60 min，将对照管、测定管、空白管样液在波长536 nm处测定吸光度值，每管重复3次，羟自由基清除率计算公式如下：

式中：D为羟自由基清除率，%；OD1为测定管的吸光度值；OD2为对照管的吸光度值；OD3为空白管的吸光度值。

2　结果与分析

2.1双水相萃取绿原酸单因素试验

2.1.1酮水比对双水相萃取绿原酸的影响

酮水比即丙酮和水的体积比，直接影响双水相萃取效果。水量过多无法形成双水相体系，过少则盐不能完全溶解；丙酮量太少也无法形成双水相，太多则会导致盐的析出。在50mL双水相体系中考察了酮水体积比分别为7.0∶3.0、7.5∶2.5、8.0∶2.0、8.5∶1.5、9.0∶1.0时双水相萃取绿原酸的效果，结果如图1所示。

图1　酮水比对双水相萃取绿原酸的影响Fig.1 Effect of acetone water volume ratio on aqueous two-phase extraction of chlorogenic acid

由图1可知，当酮水比在7.0∶3.0～8.5∶1.5时，分配系数K稳定在1.00～1.54范围波动，绿原酸收率则持续增加到88.63%。当酮水比为9.0∶1.0时，此时双水相体系下相浑浊，导致分配系数K和收率Y分别急剧下降到0.05和39.57%。因此，丙酮/K2HPO4双水相体系中，酮水比不仅影响双水相的稳定性，也是影响绿原酸萃取效果的重要因素，酮水比越大，上相对绿原酸的富集效率越高，但酮水比太大则体系不稳定，在酮水比为8.5∶1.5时，双水相体系构建最稳定，绿原酸收率最高，因此选择酮水比8.5∶1.5进行下一步试验。

2.1.2磷酸氢二钾加入量对双水相萃取绿原酸的影响

在酮水比8.5∶1.5条件下，在50 mL双水相体系分别加入2 g、3 g、4 g、5 g、6 g K2HPO4，探讨K2HPO4加入量对双水相体系萃取绿原酸的影响，结果如图2所示。

图2　磷酸氢二钾添加量对双水相萃取绿原酸的影响Fig.2 Effect of K2HPO4addition on aqueous two-phase extraction of chlorogenic acid

由图2可知，分配系数K和绿原酸收率Y均随着K2HPO4加入量的增加出现先升后降的变化趋势，在K2HPO4添加量为3 g时均达到最高值，分别为2.75和94.36%。因此K2HPO4加入量可以明显影响双水相体系萃取绿原酸的效果，50 mL丙酮/K2HPO4双水相体系萃取金银花中绿原酸的K2HPO4最佳添加量为3 g。

2.1.3绿原酸质量浓度对双水相萃取绿原酸的影响

配制绿原酸质量浓度分别为5.7g/L、11.5g/L、17.2 g/L、22.9 g/L、28.7 g/L的金银花水提液构建50 mL双水相体系，酮水比8.5∶1.5，加入K2HPO43 g，分配系数K、及绿原酸收率Y的变化结果如图3所示。

图3　绿原酸质量浓度对双水相萃取绿原酸的影响Fig.3 Effect of chlorogenic acid content on aqueous two-phase extraction of chlorogenic acid

由图3可知，分配系数K和绿原酸收率Y随着金银花水提液中绿原酸质量浓度的增加而增加，在绿原酸质量浓度为22.9 g/L时达到最大，分别比为12.26和98.46%。随着绿原酸质量浓度继续增加，分配系数K和绿原酸收率Y则开始下降，这可能是由于金银花水提液中绿原酸质量浓度超过了双水相萃取能力（如28.7 g/L），上相所能萃取容纳的绿原酸达到饱和，多余的绿原酸仍保留在下相，从而导致分配系数和绿原酸收率的降低。因此，选择选择金银花水提液中绿原酸质量浓度22.9 g/L进行下一步研究。

2.2双水相萃取绿原酸正交优化试验

为进一步优化双水相体系萃取条件，选取酮水比（A）、磷酸氢二钾添加量（B）和绿原酸质量浓度（C）为影响因素，以绿原酸收率（Y）为评价指标，进行3因素3水平正交优化试验，结果见表2，方差分析见表3。

表2　萃取条件优化正交试验结果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3　正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各因素对绿原酸萃取的影响次序为：A＞B＞C，即酮水比＞磷酸氢二钾加入量＞绿原酸质量浓度。双水相萃取绿原酸的最佳条件为A3B2C2，即在50 mL双水相体系中，酮水比为8.5∶1.5，K2HPO4加入量为3 g，绿原酸质量浓度为22.9 g/L。由表3可知，酮水比对双水相萃取绿原酸提取影响达到显著水平（P＜0.05），其他因素对结果影响均不显著。

2.3验证试验

在正交试验最佳萃取条件下，验证所得绿原酸收率为98.46%，大于正交表中最高绿原酸收率96.39%。为验证其萃取作用，将金银花水提液经浓缩干燥，测定绿原酸质量分数，平均值为16.20%。在A3B2C2最佳萃取条件下，上相萃取液经浓缩干燥，测定绿原酸质量分数，平均值为56.27%。丙酮/K2HPO4双水相体系萃取后，所得金银花提取物中绿原酸质量分数增加了2.47倍，表明该双水相体系对绿原酸的萃取和纯化作用明显。

2.4抗氧化能力评价

以VC为阳性对照，检测0.15 g/L、0.31 g/L、0.46 g/L、0.62 g/L和0.77 g/L等系列绿原酸质量浓度下金银花水提液、双水相上相萃取液、绿原酸标品溶液的羟基自由基清除能力，结果如图4所示。

羟基自由基作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病［16］。羟基自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要评价指标之一。由图4可知，3种含不同质量浓度绿原酸的样液，以绿原酸标品溶液羟基自由基清除率最低，随着绿原酸质量浓度的增加，样品液羟基自由基清除能力增强。质量浓度增加到0.75g/L时，水提液羟基自由基清除率最高，为98%；其次是上相萃取液，为82%；绿原酸标品溶液最低，为78%，但均比VC羟基自由基清除率高。因此，金银花绿原酸提取物具有较强的羟基自由基清除能力。

图4　绿原酸样品的羟自由基清除能力Fig.4 Scavenging hydroxyl radical activity of chlorogenic acid samples

金银花水提液中黄酮类、酚类、多糖类等抗氧化物质的存在，强化了其低浓度时的羟自由基清除能力［17］，使得绿原酸质量浓度为0.15g/L时，水提液羟自由基清除率优势明显，是VC标准品液的6.6倍。随着绿原酸质量浓度的增加，上相萃取液和绿原酸标品溶液的羟自由基清除率与水提液的差距逐渐缩小，使得水提液羟自由基清能力虽然最强，但优势减弱，仅为VC标准品液的1.9倍，而上相萃取液和绿原酸标品液的羟自由基清除率基本相近，分别为VC标准品液的1.6倍和1.5倍。这是由于双水相选择性萃取富集了水提液中绿原酸，其羟自由基清除率与绿原酸标品液接近，但由于仍存在黄酮类等物质，使其羟自由基清除率略高于绿原酸标品溶液。

3　结论

试验以罗田县的金银花及其茎叶为试验材料，建立了50 mL丙酮/K2HPO4双水相体系选择性萃取金银花中绿原酸的工艺，最佳条件为酮水体积比8.5∶1.5，K2HPO4添加量3 g，水提液中绿原酸质量浓度22.9 g/L。此条件下绿原酸收率为98.46%，含量为56.27%。

双水相对金银花绿原酸的萃取和纯化作用明显，所得绿原酸具有较强的清除羟基自由基的作用，对大别山金银花资源的合理开发和科学利用具有现实意义和应用前景。

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Aqueous two-phase extraction and antioxidant activity of ch1orogenic acid in honeysuck1e

HU Jiaqin1，XIANG Fu1，2*，SHI Changping1，WU Wei2，3，FANG Yuanping1，2
（1.Co11ege of Life Sciences，Huanggang Norma1 University，Huangzhou 438000，China；2.Hubei Co11aborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exp1oitation of Dabie Mountains，Huangzhou 438000，China；3.Schoo1 of Medicine，Hubei Po1ytechnic University，Huangshi 435003，China）

For reasonab1e uti1ization of Dabie Mountains honeysuck1e resources，using the f1owers，branches and 1eaves of honeysuck1e as test materia1s，the ch1orogenic acid was extracted by aqueous two-phase system，and the antioxidant activity was researched.Resu1ts indicated that the optimum extraction conditions of ch1orogenic acid in 50 m1 acetone and K2HPO4aqueous two-phase system were ketone-water ratio 8.5∶1.5（V/V），K2HPO4addition 3 g，water extract ch1orogenic acid content 22.9 g/L.Under the conditions，the content and yie1d of ch1orogenic acid was 56.27%and 98.4%，respective1y.The ch1orogenic acid had a good capacity of scavenging hydroxy1 radica1，which provided a theoretica1 basis for the deve1opment and app1ication of Dabie Mountains honeysuck1e resources.

aqueous two-phase；honeysuck1e；ch1orogenic acid；hydroxy1 radica1 scavenging；antioxidant activity

TS210.9

A

0254-5071（2015）12-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.024

2015-10-26

湖北省自然科学基金重点项目（2014CFA129）

胡佳钦（1994-），男，本科生，研究方向为天然植物资源利用。

向福（1977-），男，副教授，博士，研究方向为天然植物资源利用。