纤维素酶-压热法制备马铃薯抗性淀粉工艺参数优化

章丽琳，叶　陵，张　喻*（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

纤维素酶-压热法制备马铃薯抗性淀粉工艺参数优化

章丽琳1，2，叶陵1，2，张喻1，2*
（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

为了提高抗性淀粉的得率，并获得抗性淀粉制备方法的最佳工艺参数，该试验以马铃薯淀粉为原料，抗性淀粉得率为评价指标，采用纤维素酶-压热法制备马铃薯抗性淀粉。研究淀粉乳浓度、酶添加量、酶解时间、压热温度、压热时间5个因素对马铃薯抗性淀粉得率的影响，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化得出马铃薯抗性淀粉的最佳制备工艺条件，即淀粉乳含量25%、淀粉乳pH 5.0、酶用量30 U/mL、酶解时间50 min、压热温度125℃、压热时间30 min、老化温度4℃、老化时间18 h，在此条件下抗性淀粉的得率为30.33%。

马铃薯抗性淀粉；纤维素酶；压热法；工艺优化

抗性淀粉（resistant starch，RS）是指不能在健康人体小肠中消化吸收，而能在大肠中被发酵分解的一类淀粉及其降解物，是一种具有良好生理功能和食品加工特性的原料［1］。其具有降低甘油三酯和胆固醇含量、预防直肠癌和肠道疾病、改善肠道菌群、预防糖尿病、促进维生素和矿物质的吸收等生理功能［2-4］。根据其来源和抗酶解性的不同可将其分为4类：物理包埋淀粉（RS1）、抗性淀粉颗粒（RS2）、老化淀粉（RS3）、化学改性淀粉（RS4）［5］。其中，RS3是淀粉糊化后发生老化，直链淀粉和支链淀粉的线性部分发生重结晶得到的一种难以消化的淀粉，该类淀粉对热十分稳定，具有很高的商业价值［6］。

目前抗性淀粉的制备方法有压热法［7］、酶解法［8］、挤压法［9］、微波结合酶法［10］等。其中，酶解法因其具有较高的安全性而被广泛研究，所选用的酶主要有α-淀粉酶、普鲁兰酶、纤维素酶等［11］。纤维素酶处理可破坏纤维素等阻碍淀粉分子聚集的非淀粉物质，从而可大大提高回生抗性淀粉的得率［11］。压热法是制备回生抗性淀粉较为常用的方法，通过高温高压作用使一定浓度的淀粉乳充分糊化，再利用淀粉的老化特性，在低温条件下静置一定时间，使淀粉糊慢速冷却形成老化淀粉，即回生抗性淀粉［12］。

马铃薯在国内种植面积广、产量高，但至今仍处于加工利用初级阶段。马铃薯淀粉比其他淀粉纯度高、质量好、易转化，适宜生产抗性淀粉［13］。本试验将纤维素酶处理与压热法相结合制备RS3型马铃薯抗性淀粉，在单因素试验的基础上，通过正交试验对工艺参数进行优化以确定最佳的酶解-压热工艺，具有一定的理论和实际应用价值。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

马铃薯淀粉（其中淀粉质量分数为83.5%，含水率为16.5%）：甘肃兴达淀粉工业有限公司；纤维素酶（15000U/g）、胃蛋白酶（1 200 U/g）：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖淀粉酶（100 U/mg）、α-淀粉酶（4 000 U/g）：上海柏卡化学技术有限公司；3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosa1icy1ic acid，DNS）、盐酸、氢氧化钠、氢氧化钾、苯酚等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

ZHWY-C2102恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；LMQ.J立式灭菌器：山东新华医疗器械股份有限公司；101-2AB电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；DL-1电子可调电炉：北京中兴伟业仪器有限公司；TDZ5-WS台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；WFJ-7200可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；MDJ-D4072磨豆机：广东小熊电器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1马铃薯抗性淀粉制备的工艺流程

马铃薯淀粉→溶解→调pH值→糊化→加酶酶解→压热处理→自然冷却→回生（4℃）→烘干→粉碎→过筛

1.3.2酶法-压热处理工艺操作要点

称取一定质量的马铃薯淀粉，与水以一定比例混合，调pH至5.0，在80℃水浴中进行糊化，冷却至适宜温度，加入一定量纤维素酶进行酶解，放入高压灭菌锅中进行压热处理，一定时间后取出冷却至室温，于4℃静置18 h，取出后于室温放置4 h，后放入60℃烘箱中烘干，粉碎，过100目筛，得到成品。

1.3.3马铃薯抗性淀粉的测定方法

参考GOÑI I等［14］研究方法，将抗性淀粉转换为葡萄糖进行测定。称取所制样品5 g于100 mL烧杯中，加入pH值为1.5的HC1-KC1缓冲溶液25 mL，加入1 mL胃蛋白酶溶液，40℃恒温振荡1 h。用2 mo1/L HC1和0.5 mo1/L NaOH调节pH值为6.0，加入耐高温α-淀粉酶溶液1 mL，在95℃恒温振荡30 min，水解可消化淀粉。调节pH值为4.0，加入1 mL葡萄糖淀粉酶溶液，70℃恒温振荡1 h，水解可消化淀粉为葡萄糖，冷却、离心、弃去上清液，重复3次。加入5 mL 5 mo1/L 的KOH，水浴加热并搅拌使抗性淀粉溶解，并用5mL5 mo1/L 的HC1进行中和，加入1mL葡萄糖淀粉酶溶液，60℃恒温水浴并保持不断振荡1 h。室温冷却并离心，合并上清液，用蒸馏水定容至100 mL。

采用3，5-二硝基水杨酸（dinitrosa1icy1ic acid，DNS）法测定还原糖含量（以葡萄糖计），马铃薯抗性淀粉得率计算公式如下：

马铃薯抗性淀粉得率=还原糖含量×0.9

式中：0.9为葡萄糖与脱水葡萄糖基之间的换算系数。

1.3.4单因素试验设计

在淀粉乳含量10%、淀粉乳pH 5.0、纤维素酶用量20U/mL、酶解温度40℃、酶解时间60min、压热温度120℃、压热时间30 min、老化温度4℃、老化时间18 h的基础上，相应变换某因素的水平：淀粉乳含量5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%；纤维素酶用量20U/mL、30U/mL、40U/mL、50 U/mL、60 U/mL、70 U/mL；酶解时间20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min；压热温度110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃；压热时间20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。按1.3.1的方法制备抗性淀粉，1.3.3的方法测定抗性淀粉得率，考察各因素对抗性淀粉得率的影响。

1.3.5正交试验设计

在单因素试验基础上，选择淀粉乳含量、压热温度、酶解时间为影响因素，以马铃薯抗性淀粉得率为评价指标，进行L9（33）正交试验，探索最佳工艺条件，正交试验因素与水平如表1所示。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1淀粉乳含量对抗性淀粉得率的影响

图1　淀粉乳含量对抗性淀粉得率的影响Fig.1 Effect of starch milk content on resistant starch yield

由图1可知，抗性淀粉得率随淀粉乳含量增加而上升，当淀粉乳含量为20%时抗性淀粉得率最高，为22.6%，随后逐渐降低，淀粉乳含量过高或过低都不利于抗性淀粉的形成。淀粉乳含量过低，水分含量过高，直链淀粉分子相互接近的概率减少，难以接近形成结晶；而淀粉乳含量过高，淀粉颗粒难以充分膨胀、糊化，淀粉糊黏度很大，分子链之间相互影响较大，不利于直链淀粉分子相互接近，形成抗双螺旋和结晶［15］。故选择淀粉乳含量为20%最佳。

2.1.2纤维素酶用量对抗性淀粉得率的影响

图2　纤维素酶用量对抗性淀粉得率的影响Fig.2 Effect of cellulase addition on resistant starch yield

由图2可知，纤维素酶用量对抗性淀粉得率的影响较小。抗性淀粉得率随纤维素酶用量的增加而上升，当纤维素酶用量为30～40 U/mL时，抗性淀粉得率较高，随后缓慢降低，纤维素酶用量过高或者过低都不利于抗性淀粉的形成。酶用量过低，分子被切断程度不够，分子链过长，不易形成晶体；酶用量过高，分子链被切的过短，小分子运动过快，不利于结晶的形成，同时伴随生成的小分子糖类也会阻碍抗性淀粉的生成，同时也会使淀粉糊的黏度增大，不利于直链淀粉分子相互接近形成结晶［16］。因此选择纤维素酶用量30 U/mL为宜。

2.1.3酶解时间对抗性淀粉得率的影响

图3　酶解时间对抗性淀粉得率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on resistant starch yield

由图3可知，随着酶解时间的增加，抗性淀粉得率逐渐增大，在酶解时间为50 min时，抗性淀粉得率最大，为16.9%，酶解时间继续增加，抗性淀粉得率下降。其原因是纤维素酶的作用时间过短，释放的直链淀粉分子太少，不利于结晶，而且淀粉糊中直链分子的链过长，太长的链分子间斥力增大；纤维素酶的作用时间过长，直链分子过短，分子质量小的直链分子则运动较快，分子运动比较剧烈，而运动快的链碰撞在一起及稳定的几率相对较小，因此较难聚集，所以酶解时间过长，直链分子过短，也不利于晶体的形成［17］。因此选择酶解时间50 min为宜。

2.1.4压热温度对抗性淀粉得率的影响

图4　压热温度对抗性淀粉得率的影响Fig.4 Effect of autoclaving temperature on resistant starch yield

由图4可知，压热温度过高和过低都不利于抗性淀粉的形成，压热温度在125℃时，抗性淀粉的得率较高，为17.2%。淀粉糊中抗性淀粉的形成可以看作是高聚物的结晶过程，高聚物的结晶过程与小分子类似，也包括晶核的形成和晶粒的生长两个步骤，结晶的速度是由成核速度，晶体生长速度共同决定的［18］。压热温度低时，淀粉糊黏度增大会抑制晶体的生成，使抗性淀粉的生成受阻；当压热温度过高时，淀粉晶核遭到破坏，晶核不能够正常形成，从而抑制了抗性淀粉的形成。因此选择压热温度125℃为宜。

2.1.5压热时间对抗性淀粉得率的影响

图5　压热时间对抗性淀粉得率的影响Fig.5 Effect of autoclaving time on resistant starch yield

由图5可知，压热时间对抗性淀粉得率的影响较小。随着压热时间增加，抗性淀粉得率增大，当压热时间为30～50 min时抗性淀粉得率相对较高，压热时间继续增加，抗性淀粉的得率会下降。压热时间过短，淀粉未充分吸水释放出足够的直链淀粉，直链淀粉分子尚未完全游离出来，不利于直链淀粉分子间相互接近形成结晶；压热时间过长，造成淀粉分子发生过度降解，产生一些相对分子质量小的短链直链淀粉，这也不利于抗性淀粉的形成。因此选择压热时间30℃为宜。

2.2优化正交试验结果与分析

在单因素试验基础上，固定纤维素酶用量为30 U/mL、压热时间为30 min，选择淀粉乳含量、压热温度、酶解时间进行L9（33）正交试验确定制备马铃薯抗性淀粉的最佳工艺条件，正交试验结果与分析见表2，方差分析结果见表3。

表2　马铃薯抗性淀粉制备工艺条件优化正交试验结果与分析Tab 2 Results and analysis of orthogonal experiments for preparation processing conditions of potato resistant starch optimization

表3　正交试验结果方差分析Tab 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，各试验因素对抗性淀粉得率影响大小顺序为：酶解时间＞淀粉乳含量＞压热温度，最佳工艺组合为A3B2C2。在此工艺条件下进行验证试验，重复3次，得到抗性淀粉得率为30.42%、30.25%、30.33%，平均值为30.33%，高于正交试验结果中最高得率，说明此正交优化得出的制备工艺条件可行。故采用纤维素酶-压热协同方法制备马铃薯抗性淀粉的最佳工艺组合为淀粉乳含量25%、纤维素酶用量30 U/mL、酶解时间50 min、压热温度125℃、压热时间30 min。

由表3可知，淀粉乳含量、压热温度、酶解时间对抗性淀粉得率具有显著性影响（P＜0.05），且影响大小顺序为酶解时间＞淀粉乳含量＞压热温度。

3　结论

本研究以马铃薯淀粉为原料，抗性淀粉得率为评价指标，在单因素试验的基础上进行正交试验，确定纤维素酶-压热法制备马铃薯抗性淀粉的最佳工艺条件为淀粉乳含量25%、淀粉乳pH 5.0、纤维素酶用量30 U/mL、酶解温度40℃、酶解时间50 min、压热温度125℃、压热时间30 min、老化温度4℃、老化时间18 h。在此工艺条件下，马铃薯抗性淀粉的得率可达到30.33%。连喜军等［7］单独利用纤维素酶处理制备马铃薯抗性淀粉，其最高得率为17.748%；宋洪波等［12］单独利用压热法制备淮山药抗性淀粉，其最高得率为25.27%。说明纤维素酶处理与压热法结合能够提高抗性淀粉制备得率。

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Optimization of ce11u1ase-autoc1ave method process parameters for preparation of potato resistant starch

ZHANG Li1in1，2，YE Lin1，2，ZHANG Yu1，2*
（1.Co11ege of Food Science and Techno1ogy，Hunan Agricu1tura1 University，Changsha 410128，China；2.Hunan Province the Key Laboratory of Food Science and Biotechno1ogy，Changsha 410128，China）

In order to improve the yie1d of resistant starch and obtain the optimum process parameters for potato resistant starch preparation，using the potato starch as raw materia1，resistant starch yie1d as eva1uation indexes，potato resistant starch was manufactured by ce11u1ose-autoc1ave method. The effects of starch mi1k content，enzyme addition，enzymo1ysis time，autoc1aving temperature and time on potato resistant starch yie1d were researched.By sing1e factor experiments and orthogona1 experiments，the optimum process parameters for preparation of potato resistant starch were starch mi1k content 25%，starch mi1k pH 5.0，enzyme 30 U/m1，enzymo1ysis time 50 min，autoc1aving temperature 125℃，autoc1aving time 30 min，aging temperature 4℃and aging time 18 h.Under the conditions，the yie1d of resistant starch was 30.33%.

potato resistant starch；ce11u1ase；autoc1ave method；process optimization

TS210.9

A

0254-5071（2015）12-0105-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.023

2015-10-27

湖南省教育厅优秀青年项目（11B061）

章丽琳（1991-），女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏。

张喻（1972-），女，教授，博士，研究方向为农产品加工与贮藏。