发酵剂用量对硬质蒙古干酪蛋白质、脂类水解和微观结构的影响

高　鑫，张　亮，李　博（.上海工会管理职业学院 健康安全系，上海 045；.上海交通大学 医学院，上海 0040）

发酵剂用量对硬质蒙古干酪蛋白质、脂类水解和微观结构的影响

高鑫1，张亮2，李博1
（1.上海工会管理职业学院 健康安全系，上海 201415；2.上海交通大学 医学院，上海 200240）

该文通过添加不同发酵剂用量制作了3种硬质蒙古干酪，并对硬质蒙古干酪的理化性质、蛋白质和脂肪水解程度、微观结构等进行了研究。结果表明，随着发酵剂用量增多，除D-乳酸含量外，其他理化指标均随发酵剂用量的增大而减小；粗蛋白质和粗脂肪的含量减少；pH 4.6-可溶性氮（SN）含量和12%三氯乙酸（TCA）-SN含量均增加，表明干酪中蛋白质和脂肪的水解程度增大；游离氨基酸和游离脂肪酸的含量增加，表明干酪的风味物质增多。随着发酵剂用量的增多，干酪酸化速度加快，质地相对松散。最终确定发酵剂使用量为1.0 g/L，在此条件下，脂肪和蛋白质的水解程度适中，游离氨基酸种类丰富，能够满足干酪风味化合物生成的需求。

硬质蒙古干酪；蛋白质水解；脂肪水解；微观结构

内蒙古草原以畜牧业为主，是传统奶制品的发源地之一，干酪是奶制品中最普遍的食品，为蒙古族人所喜爱［1］。干酪是在乳中加入适量发酵剂和凝乳酶，排除乳清而得到的浓缩聚合物，营养丰富，有“奶黄金”之称［2］。联合国粮农组织（food and agricu1ture organization，FAO）和世界卫生组织（wor1d hea1th organization，WHO）制定的有关于干酪的国际通用定义为：以牛乳、奶油、部分脱脂乳、酪乳或这些产品的混合物为原料，经凝乳并分离乳清而制得的新鲜或发酵成熟的乳制品［3］。

蒙古族干酪（简称“蒙古干酪”）是以羊奶或牛奶为原料制作而成，在传统乳制品中独树一帜，倍受国内外游客的青睐。目前蒙族牧民传统干酪的生产中没有固定的菌种，采用自然发酵。在制作工艺上采用家庭式手工生产，制作工艺简单，操作条件不严格，导致蒙古干酪产品性能不稳定、口味不一［4］。随着蒙古干酪的流行，手工制作方式难以满足需求。因此，蒙古干酪的工业化生产迫在眉睫。干酪发酵剂通常分为细菌发酵剂和霉菌发酵剂两大类。细菌发酵剂主要以乳酸菌为主，包括乳酸链球菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌等。霉菌发酵剂主要使用的是对脂肪分解能力强的卡门培尔干酪霉菌、干酪青霉、娄地青霉等［5-6］。本实验以嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌为发酵剂，探讨了蒙古干酪制作过程中发酵剂用量对干酪理化性质、蛋白质和脂肪水解及干酪微观结构的影响，确定合适的发酵剂使用量，为进一步工业化生产蒙古干酪提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

嗜热链球菌（Streptococcus thermophi1es）和保加利亚乳杆菌（Lactobaci11us bu1garicus）：北京川秀国际贸易有限公司；原料乳：光明乳业上海金山牧场，并对牛乳进行标准化；凝乳酶（酶活力5 100～5 900 IMCU/g）：法国丹尼斯克公司；D/L-乳酸检测试剂盒、乙醇检测试剂盒：德国拜发R-Biopharm公司；氯化钠、无水乙醇、无水乙醚、氨水、石油醚（沸程30～60℃）、浓硫酸（98%）、氢氧化钠、硼酸、硫酸铜、硫酸钾、邻苯二甲酸氢钾、乙酸、乙酸钠、三氯乙酸（trich1oroacetic acid，TCA）、戊二醛（25%）均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；盐酸标准液（0.1 mo1/L）、氢氧化钾标准液（0.1 mo1/L）：上海化工研究院。

1.2仪器与设备

FE20 pH计：瑞士梅特勒-托利多公司；MIR-154恒温培养箱：三洋电机贸易株式会社；GL-20实验型干酪生产设备：上海顺仪实验设备有限公司；SX2数控马弗炉：上海雷韵试验仪器制造有限公司；FOSS K2300凯氏定氮仪：瑞典福斯公司；Sirion 2000高分辨场发射扫描电子显微镜：美国FEI公司；Biopharm乳酸检测分析试剂盒、Biopharm乙醇检测分析试剂盒：德国拜发公司；L-8900全自动氨基酸分析仪：日本Hitachi公司。

1.3方法

1.3.1硬质蒙古干酪的制作工艺流程［7］

原料乳→验收、标准化→灭菌→冷却→添加发酵剂→加凝乳酶→凝乳切割→凝块中加盐→装模成型、压膜→成熟

操作要点：将验收、标准化的原料乳进行巴氏灭菌（63℃、30 min）后冷却至30℃，加入发酵剂（嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌（2∶1）），当pH降低0.1时，添加凝乳酶（0.03 g/L原料乳），32℃凝乳40 min，将凝乳切块成1 cm左右的凝块，排除乳清后在凝乳粒中加盐，加盐量为30 g/kg凝块，加盐后的干酪装入模具中挤压成型，放入8℃、相对湿度（re1ative humidity，RH）85%的恒温恒湿箱内成熟21 d。根据发酵剂用量的不同，记为干酪A（0.5 g/L原料乳）、干酪B（1.0 g/L原料乳）和干酪C（1.5 g/L原料乳），对成熟的干酪取样进行各项指标检测。

1.3.2干酪理化性质测定

干酪水分含量测定：依照GB/T 5009.3—2003《食品中水分含量的测定》中的方法。干酪灰分含量测定：依照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的测定》中的方法。干酪pH值测定：直接使用干酪pH计测定干酪pH值。乳酸含量测定：D-乳酸和L-乳酸含量的测定：使用Biopharm乳酸检测分析试剂盒测定，操作步骤按照使用说明书进行。乙醇含量测定：使用Biopharm乙醇检测分析试剂盒测定，操作步骤按照使用说明书进行。

1.3.3干酪蛋白质水解程度检测

（1）干酪粗蛋白含量测定

总氮含量的测定采用凯氏定氮法。蛋白质含量测定依照GB 5009.5—2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的方法，计算公式如下：

蛋白质含量=总氮含量（%）×6.38

式中：6.38为干酪蛋白质换算系数。

（2）可溶性氮及游离氨基酸含量的测定

pH 4.6-可溶性氮（so1ub1e nitrogen，SN）含量的测定采用MEI J等［8］的方法，准确称取0.750 0 g干酪于离心管中，然后加入30 mL pH 4.6的乙酸盐缓冲溶液，溶解后，以4 000 r/min离心20 min，取上清液，通过减重法取10 mL上清液，将其移入凯氏消化瓶中，测定其氮含量，pH 4.6-SN含量计算公式如下：

式中：X1为上清液中氮含量，%；m为干酪的质量，g；m1为离心后上清液的质量，g；m2为采用减重法后10 mL上清液的质量，g。

12%TCA-SN含量测定采用MEI J等［8］的方法：准确称取1.5000g干酪于离心管中，然后加入30 mL12%的TCA溶液，溶解后，4 000 r/min转速离心20 min，取上清液，通过减重法取10 mL上清液，将其移入凯氏消化瓶中，测定其含氮量，12%TCA-SN含量计算公式如下：

式中：X2为上清液中氮含量，%；m为干酪的质量，g；m1为离心后上清液的质量，g；m2为采用减重法后10 mL上清液的质量，g。

游离氨基酸含量测定采用MEI J等［8］的方法：称取1.000 g干酪，用超纯水溶解后定容至5 mL，以4 000 r/min离心30 min，取1 mL上清液，加入2倍体积10%的TCA溶液，充分混匀，-20℃冷冻静置15 min；4℃、转速10 000 r/min离心15 min，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤样品，调整样品pH值为2.0。通过全自动氨基酸分析仪，采用茚三酮柱后衍生法对干酪中游离氨基酸含量进行检测。

1.3.4干酪脂肪水解程度检测

干酪粗脂肪含量测定：采用罗兹哥特里法［9］。干酪游离脂肪酸含量测定根据国标GB/T 5530—2005《动植物油脂酸值和酸度测定》中的方法进行测定，结果以油酸计。

1.3.5干酪微观结构的测定

取一小块干酪（5 mm×5 mm×5 mm）于2.5%戊二醛溶液中，4℃放置4 h进行固定，然后用0.2 mo1/L磷酸缓冲液清洗2～3次，每次15 min，再分别用体积分数15%、30%、50%、70%乙醇溶液各脱水10 min，体积分数85%及95%乙醇溶液各脱水15 min，再用无水乙醇脱水1 h，将样品放入液氮中进行临界点干燥，用离子覆膜机镀金后扫描电镜观察并拍照。

2　结果与分析

2.1干酪理化性质的检测

3种硬质蒙古干酪理化性质的检测结果见表1。

表1　硬质蒙古干酪的理化性质Table 1 Physicochemical properties of hard Mongolian cheese

由表1可知，除D-乳酸含量外，其他理化指标均随发酵剂用量的增大而减小，3种硬质蒙古干酪水分含量在42.94%～44.92%之间，符合硬质干酪的水分含量要求［10］。乳酸对干酪风味的形成有很大的作用，干酪中残余的乳糖在干酪成熟过程中会逐渐被乳酸菌分解为乳酸，同时，乳酸也会进一步反应生成乙酸，导致乳酸含量减少。发酵剂用量越大，L-乳酸的含量减少，可能与其转化为其他代谢产物有关，从保健角度看，过量食用D-乳酸会导致尿中出现高酸度现象，引起代谢紊乱，所以世界卫生组织限制人体每天摄入D-乳酸量在100 mg/kg体质量以下。在干酪中D-乳酸含量与L-乳酸含量变化之间在统计学上没有必然关系，可能是由于干酪在成熟过程中发生了消旋作用，DEIANA P等［11］在研究由乳酸菌和酵母菌组成的混合发酵剂制作Pecorino Romano干酪过程中乳酸和乙酸的代谢时，也发现了这种情况。干酪中很多代谢途径都与乙醇的合成有关，一般来说，乙醇主要通过下列生化途径生成：乳糖代谢、甲基酮降解、氨基酸代谢和亚油酸、亚麻酸的降解产生［12］。乙醇和干酪中的脂肪酸会发生反应，产生乙酯类化合物，是干酪重要的挥发性风味化合物，发酵剂使用量越大，乙醇含量越小，说明乙醇参与代谢的程度越大，发酵剂微生物越活跃。在3种干酪的制作过程中，由于干酪C发酵剂用量大，酸化原料乳速度相对较快，缩短了干酪的制作时间。但会导致凝乳收缩过度，乳清过量析出，质地相对松散，而干酪A和干酪B质地比较紧密，韧性较好。高发酵剂使用量会导致较低的pH值，使得酪蛋白持水性降低，对干酪的硬度造成影响。

2.2干酪中蛋白质和脂类水解程度

在干酪的制作过程中，大部分的凝乳酶随入乳清排出，而在之后的储藏过程中干酪中的蛋白质水解，主要是由残存在干酪中的少量凝乳酶造成的［13］。干酪中残存的凝乳酶继续作用于酪蛋白形成肽类，进一步被降解形成小肽及氨基酸。蛋白质降解后，可溶性组分增加，因此，干酪浸出物中氮组分的数量和种类常作为干酪成熟过程中蛋白质降解的标志。干酪中蛋白质和脂类水解程度变化结果见表2。

表2　硬质蒙古干酪中蛋白质和脂肪的水解程度Table 2 Hydrolysis degree of protein and fat in the hard Mongolian cheese %

由表2可知，随发酵剂用量增多，干酪中蛋白质含量减少，可溶性氮含量增多，可能是由于干酪发酵剂用量多，微生物分泌的蛋白质水解酶总量也较多，蛋白质水解的速度相对也快。一般认为pH 4.6-SN表示了蛋白质水解的广度，它主要分离出的是小肽和中肽［14］。在干酪成熟过程中，粗蛋白质减少越多，pH 4.6-SN增加也就越多。同时，pH 4.6-SN受到发酵剂使用量的影响，发酵剂使用量越多pH 4.6-SN增加的也就越快。而12%TCA-SN是干酪成熟的指标之一，它反映了干酪中蛋白质水解的深度。12%TCA-SN中主要成分是小分子肽和游离氨基酸，由凝乳酶和发酵剂产生的肽酶共同作用而产生的［15］。12%TCA-SN含量受到发酵剂用量的影响，用量越多，12%TCA-SN的生成量越大。蛋白质水解速度前期较快，中后期缓慢，发酵剂使用量多，蛋白质水解的速度也快。所以整体上来说，蛋白质水解速度顺序是干酪C＞干酪B＞干酪A。在干酪成熟期间，pH 4.6-SN一直呈现增加趋势，一般来讲，粗蛋白质减少越多，pH 4.6-SN增加也就越多。

干酪成熟过程发生的脂肪水解对干酪的风味和感官影响至关重要，水解产生的游离脂肪酸会直接影响干酪的风味，同时游离脂肪酸可以通过酶促反应或化学反应产生风味物质。由表2可知，发酵剂用量增加，干酪A、B、C中粗脂肪含量减少，游离脂肪酸含量有所增长，说明脂肪水解程度越大。

游离氨基酸可以给干酪提供风味支持，本身可呈现出一定的滋气味，同时也是大量风味物质的前体［16］。干酪中游离氨基酸种类和含量的检测结果见表3。由表3可知，干酪A和C检测出16种氨基酸，干酪B检测出15种氨基酸。干酪C中游离氨基酸总含量最高，由于发酵剂使用量越大，分解蛋白质能力越强，产生的游离氨基酸量也会明显增加。在检测的所有16种氨基酸中，谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、脯氨酸等7种氨基酸含量较高，约占了游离氨基酸总含量的80%左右。其中，谷氨酸含量最高，主要呈现酸味。苏氨酸、丝氨酸和甘氨酸可以为硬质蒙古干酪提供一定的甜味。游离氨基酸中的天门冬氨酸、谷氨酸的出现使得干酪的酸味会明显加强，亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸的增加使得干酪存在一定苦味，由于干酪加工过程中产酸使得干酪后期的酸味、苦味会加强，其程度随着发酵剂用量的增加而增加。

表3　硬质蒙古干酪中游离氨基酸的种类和含量Table 3 Species and contents of free amino acids in the hard Mongolian cheese mg/kg干酪

2.3干酪的微观结构

干酪的微观结构主要是蛋白质相形成的复杂排列组合，硬质蒙古干酪是一种酶凝干酪，其形成的蛋白纤维结构较薄［17］。3种干酪在扫描电子显微镜微观结构见图1。发酵剂使用量越多，酪蛋白水解程度越大，由酪蛋白构成的连续结构逐渐水解为短链结构，酪蛋白矩阵结构钝化，并开始出现新的空穴，表现为干酪结构多孔而致密。所以，干酪A的微观结构表现为团状，而干酪C表现为多空，干酪B的微观结构在两者的过渡态。微观结构图1A、1B、1C可见明显的孔状结构，孔状结构主要是在样品前处理过程中脱水脱脂所形成。在干酪中，聚集的脂肪球会镶嵌在酪蛋白胶束形成的网状结构中，限制了脂肪球基粒的收缩，控制了孔状结构的大小分布。孔状结构有利于游离脂肪、水以及其他物质（矿物质、小肽和各种酶）的储藏，这样的脂肪球组成的脂肪相和干酪蛋白的蛋白相间具有一定的流动性。同时可以看见明显的由副酪蛋白磷酸钙和酪蛋白颗粒形成的基粒，这样的基粒构成了一个连续性较强的长链状聚集物，由于聚集基粒的分子间疏水作用和静电引力而形成了大体的交联结构。

图1　三种硬质蒙古干酪扫描电子显微镜微观结构Fig.1 The microstructure of three kinds of hard Mongolian cheese by scanning electron microscope

3　结论

本实验通过添加不同质量浓度的发酵剂制作了3种硬质蒙古干酪，对比了3种干酪的理化指标、蛋白质和脂肪的水解程度、微观结构。结果表明，随着发酵剂用量增多，除D-乳酸含量外，其他理化指标均随发酵剂用量的增大而减小；粗蛋白质和粗脂肪的含量减少，pH 4.6-SN含量和12%TCA-SN含量增加，表明干酪中蛋白质和脂肪的水解程度增大；游离氨基酸和游离脂肪酸的含量增加，表明干酪的风味物质增多。干酪C酸化速度较快，质地相对松散，干酪A发酵凝乳时间较长，较难排出乳清，而干酪B在酸化原料乳达到合适凝乳pH值和凝乳状态的判断中均具有优势，且干酪B含水量适中，硬度适中。在此条件下，脂肪和蛋白质的水解程度合适，游离氨基酸较为丰富，能够满足干酪风味化合物生成的需求。因此，确定发酵剂使用量为1.0 g/L原料乳，在此条件下所制得的干酪具有良好的蛋白质和脂肪水解能力。

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Effect of starter addition on proteo1ysis，1ipo1ysis and microstructure of hard Mongo1ian cheese

GAO Xin1，ZHANG Liang2，LI Bo1（1.Department of Hea1th and Security，Shanghai Trade Union Po1ytechnic Co11ege，Shanghai 201415，China；
2.Schoo1 of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China）

The three hard Mongo1ia cheese were manufactured with different starter addition，and the physicochemica1 property，proteo1ysis，1ipo1ysis and microstructure of the cheeses were researched.Resu1ts indicated that aside from D-1actic acid content，other physicochemica1 indicators were decreased with increasing starter addition，and the content of crude protein and crude fat were decreased.However，the content of pH 4.6-SN and 12% TCA-SN was increased，which indicated that the hydro1ytic degree of protein and fat in the cheeses was increased.The content of free amino acid and free fatty acid was increased，which indicated that the f1avor compounds of chesses were increased.With the increasing of starter addition，acidification speed of cheese was speeded up，and the texture was re1ative1y 1oose.Fina11y，the starter addition was determined as 1.0 g/L.Under the condition，the hydro1ytic degree of protein and fat in the cheeses was moderate，kinds of free amino acid were abundant，which cou1d meet the generated need of cheese f1avor compounds.

hard Mongo1ian cheese；proteo1ysis；1ipo1ysis；microstructure

TS201.3

A

0254-5071（2015）12-0088-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.019

2015-08-20

上海市高校选拔培训优秀青年教师科研专项基金资助项目（ghz09005）

高鑫（1982-），男，讲师，硕士，主要从事乳品科学相关研究工作。