一株放线菌菌株HDF-1的分离、鉴定及抑菌活性研究

王晓琴，张小花，安　玲，朱珍珍，曹　礼*（.河西学院 农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.河西学院 甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000）

一株放线菌菌株HDF-1的分离、鉴定及抑菌活性研究

王晓琴1，2，张小花1，安玲1，朱珍珍1，曹礼1，2*
（1.河西学院 农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；
2.河西学院 甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000）

从黑河湿地土壤样品中分离得到一株中度嗜碱放线菌HDF-1，适宜生长pH值为8～10，培养时可以向细胞外分泌蛋白酶、淀粉酶，不能分解含硫氨基酸产生硫化氢，不能产生胞外纤维素酶。菌株HDF-1能够利用葡萄糖、果糖、蔗糖以及麦芽糖作为碳源；该菌株代谢产物中含有抑制金黄色葡萄球菌（Staphy1ococcus aureus）的活性物质，抑菌圈直径达到了15.2 mm，而对黑曲霉（Aspergi11us niger）、青霉（Penici11ium chrysogenum）和大肠杆菌（Escherichia co1i）的生长没有抑制作用。根据菌株HDF-1的形态特征、生理生化特征及其16S rRNA系统进化分析，将该菌株鉴定为链霉菌属（Streptomycessp.）。

湿地；放线菌；鉴定；抑菌活性

湿地是分布于陆地生态系统和水生生态系统之间具有独特水文、土壤、植被与生物特征的生态系统，全球约5%～8%的地球陆地表面被湿地覆盖［1-2］。湿地具有独特的生态结构和功能，富有生物多样性，是人类最重要的生存环境之一，在涵养水源、调节气候、净化水质、防风固沙、减轻沙尘暴危害、阻止沙漠侵蚀，维护区域生态安全等方面发挥重要作用［3-4］。

微生物作为湿地生态系统的主体和核心，在物质的矿化、硝化、反硝化等过程中起到关键作用［5-7］。微生物种群结构的多样性、稳定性和种群恢复性在维护湿地生态系统的有效性中起着关键作用［8-9］。通过分离、纯化湿地环境样品中的微生物群，利用其生物作用提高湿地土壤质地、改善湿地土壤生态环境、增强土壤酶活力、保护和恢复湿地资源与环境，就显得尤为重要。

本研究从黑河湿地得到一株中度嗜碱放线菌HDF-1，研究其形态特征、生理生化特征和16S rRNA序列，并研究其抑菌活性，以期通过湿地微生物的研究为改善和恢复黑河湿地土壤生态环境、提高土壤质地、增强土壤酶活力，为保护湿地生态系统提供基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1分离材料与试验菌株

土壤样品采自张掖国家级湿地公园；金黄色葡萄球菌（Staphy1ococcus aureus）、黑曲霉（Aspergi11us niger）、青霉（Penici11ium chrysogenum）和大肠杆菌（Escherichia co1i）均为实验室保存。

1.1.2培养基

高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0 g、硝酸钾1.0 g、氯化钠0.5 g、磷酸氢二钾0.5 g、硫酸镁0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4。无碳源基础培养基：硫酸铵2.64 g、磷酸二氢钾2.38 g、磷酸氢二钾5.65 g、硫酸镁1.0 g、硫酸铜0.006 4 g、硫酸亚铁0.001 1 g、氯化锰0.0079g、硫酸锌0.0015g、蒸馏水1000mL，pH值为7.2～7.4。

无氮源基础培养基：葡萄糖10.0 g、磷酸二氢钾2.38 g、磷酸氢二钾5.65 g、硫酸镁1.0 g、硫酸铜0.006 4 g、硫酸亚铁0.001 1 g、氯化锰0.007 9 g、硫酸锌0.001 5 g、蒸馏水1 000 mL，pH为7.2～7.4。固体培养基在上述培养基的基础上加入15 g/L的琼脂。

1.1.3化学试剂

分子操作中所用的酶、抗生素和载体pMD19-T均购自大连宝生物工程有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其余试剂为国产分析纯。

1.2仪器与设备

DPX-9272B-1电热恒温培养箱：上海福玛实验设备有限公司；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HZQ-X400恒温振荡培养箱：太仓市华美生化仪器厂；LRH-250-Z振荡培养箱：广东省医疗器械厂；B-260恒温水浴锅：上海亚荣生化仪器厂；SWCJ-1型超净工作台：苏州净化设备；Cyc1er PCR仪：美国ABI公司；TGL-16G离心机：上海安亭科学仪器厂；DYCP-31DN型电泳仪：北京市六一仪器厂。

1.3方法

1.3.1样品的采集与处理

从张掖国家级湿地公园的不同位置取样，将土样均匀混合并装在预先灭菌的三角瓶中，密封。取混匀后的土样10 g，放入盛90 mL无菌水并带玻璃珠的三角瓶中，28℃振荡30 min，使土样与水充分混合，将微生物分散。取适量样品悬液连续稀释涂布于含3%重铬酸钾的高氏一号培养基上，于28℃恒温培养一周左右，然后挑取单菌落，在高氏一号培养基培养，经连续分离纯化后，得到纯化的菌株，命名为HDF-1，将纯化的菌落转至斜面，4℃条件保存。

1.3.2菌株HDF-1的形态特征

采用插片法将菌株HDF-1接种于高氏一号培养基平板上，于28℃恒温培养箱中倒置培养6～15 d，观察细菌生长情况及菌落特征，借助插片法经0.1%美蓝染色后在光学显微镜下观察形态学特征［10］。

1.3.3菌株HDF-1的生理生化特征鉴定

菌株HDF-1的部分生理生化特征鉴定参考《放线菌快速鉴定与系统分类》进行［11］。

1.3.4菌株HDF-1的16S rDNA扩增和序列测定

以菌株HDF-1的总DNA为模板，使用通用引物来扩增菌株HDF-1的基因［12］。5’端引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（Escherichia co1ibases 8-27），3’端引物为5’-TACCTTGTTACGACTT-3’（E.co1ibase 1507-1492）。50 μL的反应体系：10×buffer 5.0 μL，氯化镁（25 mmo1/L）4.0 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonuc1eoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmo1/L）4.0 μL，模板DNA（50.0 ng/μL）1.0 μL，引物1（1 mmo1/L）1.0 μL，引物2（1 mmo1/L）1.0 μL，rTaq酶（5.0 U/μL）1.0 μL，超纯水33.5 μL。聚合酶链反应（po1ymerase chain reaction，PCR）扩增条件为：94℃预变性2 min，进入热循环；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。16SrDNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3.5菌株HDF-1抑菌实验

将菌株HDF-1接种于高氏一号培养基上，采用滤纸片法测定菌株HDF-1的抑菌活性，在滤纸上分别接种于金黄色葡萄球菌（Staphy1ococcus aureusW18）、大肠杆菌（Escherichia co1iW06-1）、黑曲霉（Aspergi11us nigerYY-12）、青霉（Penici11ium chrysogenumPTY-1），于28℃恒温箱倒置培养6～15 d，取出观察，记录抑菌圈直径大小。

2　结果与分析

2.1菌株HDF-1的形态特征

经过连续的分离与纯化，从黑河湿地样品中得到一株放线菌菌株，命名为HDF-1。该菌株在高氏一号培养基中28℃划线培养5 d后其菌落形态特征结果如图1所示。

图1　菌株HDF-1在高氏一号培养基上不同时间的生长状况Fig.1 The growth of strain HDF-1 in Gause'sⅠmedium at different time

由图1A可知，菌落呈淡黄色，不透明，表面光滑，继续培养菌落呈绒状或颗粒状，干燥，不易挑起；培养7 d后，如图1B所示，菌落呈乳白色，不透明，表面呈绒状或毛状，干燥，易挑起；培养9 d后，如图1C所示，菌落逐渐呈灰紫色，表面产生细微的水珠，潮湿，易挑起；培养15 d后，如图1D所示，菌落呈灰紫色，表面干燥，呈绒状或粉状，易挑起。

借助插片法经0.1%美蓝染色后在光学显微镜下观察，菌株HDF-1菌丝及孢子形态学特征见图2。

图2　放线菌菌株HDF-1的菌丝形态及孢子形态Fig.2 Mycelium and spore morphology of actinomycetes HDF-1

由图2可知，菌丝有大量分支，不断裂，气生菌丝分化成柔曲状孢子丝，孢子呈圆形，表面光滑。

2.2菌株HDF-1的生理生化特性

表1　菌株HDF-1的部分生理生化特征Table 1 Part physiological and biochemical characteristics of strain HDF-1

菌株的部分生理生化特征如表1所示。由表1可知，在供试的几种碳源中，该菌株对葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖利用较好，其中对葡萄糖利用最好，而对乳糖、木糖、阿拉伯糖、糊精则不能利用。在供试的几种氮源中，该菌株对硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、尿素和蛋白胨利用较好，其中对硝酸铵和蛋白胨利用最好，而对硝酸钠、草酸铵、酵母粉和玉米粉不能利用；菌株HDF-1可以产生黑色素、可以液化明胶、在过氧化氢酶和试验中呈阳性，可以水解淀粉，但不能产H2S，不能降解纤维素、牛奶胨化实验呈阴性。菌株HDF-1在pH值为8～10时生长良好，pH值为10时长势最好；最适生长温度为28℃。

2.3菌株HDF-1基因组的提取及扩增

以分离筛选所获得的菌株HDF-1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果见图3。由图3可知，基因组DNA在电泳图上的23 130 bp附近一条明显的条带，PCR扩增后得到长约1.5 kb的片段，证明PCR扩增成功。将纯化后的PCR产物连接到载体pMD19-T上，转化至大肠杆菌中，送样测序。

2.4放线菌菌株HDF-1的系统进化分析

图4　菌株HDF-1的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain HDF-1

根据16SrRNA基因的测序结果，将其序列与EzTaxon-e server（http：//eztaxon-e.ezbioc1oud.net/）数据库中16S rRNA基因序列进行同源性比较［13］，采用CLUSTAL_X将菌株HDF-1的16S rRNA基因序列与其同源关系相近序列比对分析后［14］，用MEGA version 5.0软件转换格式后，采用邻近法构建系统进化树［15］，结果如图4所示。由图4可知，菌株HDF-1与菌株纤维黄链霉菌NBRC 13780（Streptomyces ce11u1of1avusNBRC 13780）和白长链霉菌NBRC 13465 （Streptomyces a1bo1ongusNBRC 13465）有最大的序列相似性，皆为99.04%。结合菌株HDF-1的形态特征、生理生化特性及其16S rDNA系统进化分析，将分离所得菌株HDF-1鉴定为链霉菌（Streptomycessp.）。

2.5菌株HDF-1的抑菌实验

采用滤纸片法检测放线菌菌株HDF-1是否具有抑菌作用，结果如表2所示。由表2可知，放线菌菌株HDF-1对大肠杆菌、黑曲霉和青霉则无抑菌作用；对金黄色葡萄球菌有明显抑菌作用，抑菌圈直径在第6天时达到15.20 mm，培养到第9天抑菌圈直径减小至11.46 mm。这可能是由于随着培养时间的延长，前体物质耗尽或者次级代谢产物积累引起自身反馈调节，导致抑菌活性物质产量降低，从而导致第9天时抑菌圈直径小于第6天。一般认为，抑菌圈直径达到10 mm以上，即具有了较强的抑菌性［16］。

表2　菌株HDF-1的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of strain HDF-1

3　结论

本研究经过分离与纯化，从张掖黑河湿地的样品中得到一株放线菌菌株HDF-1。该菌株的菌落呈放射状生长，在高氏一号液体培养基中气生菌丝呈金黄色，单个孢子呈球形；气生菌丝体覆盖在菌落边缘，形成毛状边缘，成熟的菌落呈灰紫色，孢子丝形状为柔曲状。

该菌株HDF-1是一株中度嗜碱的放线菌，生长pH值为7～11，最适生长pH值为10，可以向细胞外分泌蛋白酶、淀粉酶，不能产生纤维素酶，不能分解含硫氨基酸产生硫化氢，能够利用葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖作为碳源。结合菌株HDF-1的形态特征、生理生化特性及其16S rDNA系统进化分析，将分离所得菌株HDF-1鉴定为链霉菌（Streptomycessp.）。菌株HDF-1的代谢产物对金黄色葡萄球菌有明显抑菌作用，抑菌圈直径在第6天时达到15.20 mm，对大肠杆菌、黑曲霉和青霉则无抑菌作用，在保护湿地生态系统中，该菌株具有潜在的应用前景。

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Iso1ation，identification and the antimicrobia1 activity of an actinomycetes strain HDF-1

WANG Xiaoqin1，2，ZHANG Xiaohua1，AN Ling1，ZHU Zhenzhen1，CAO Li1，2*
（1.Co11ege of Agricu1ture and Biotechno1ogy，Hexi University，Zhangye 734000，China；
2.Key Laboratory of Hexi Corridor Resourses Uti1ization of Gansu，Hexi University，Zhangye 734000，China）

A moderate1y basophi1ic actinomycetes HDF-1 was iso1ated from soi1 samp1e of Heihe wet1and.The suitab1e pH for growth was 8-10.The strain HDF-1 cou1d secrete protease and amy1ase，cou1d not break down the su1fur amino acid to produce hydrogen su1fide，and cou1d not produce extrace11u1ar ce11u1ose.Strain HDF-1 cou1d uti1ize g1ucose，fructose，sucrose and ma1tose as carbon source.The metabo1ites of strain HDF-1 contained active substances that cou1d inhibitStaphy1ococcus aureus，and the diameter of antibacteria1 circ1e reached to 15.2 mm，whi1e it had no inhibitory effect onAspergi11us niger，Penici11ium chrysogenumandEscherichia co1i.By the morpho1ogica1 characteristics，the physio1ogica1 and biochemica1 characteristics and the phy1ogenetic ana1ysis of the 16S rRNA gene，the strain HDF-1 was identified asStreptomycessp.

wet1and；actinomycetes；characterization；antimicrobia1 activity

Q93

A

0254-5071（2015）12-0044-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.010

2015-10-28

河西走廊特色资源利用重点实验室项目（No.XZ1401）

王晓琴（1964-），女，高级实验师，本科，研究方向为应用微生物学。

曹礼（1977-），男，副教授，博士，研究方向为环境微生物学。